Hirschil الثقة، مايكل سابرستين الطبية علماء أبحاث صناديق، وزمالة جامعة نيويورك وايتهيد أيد هذا العمل.

1. طلاء صفيحة ميكروسكوبية ويلز ملاحظة: إن الهدف من هذه الخطوة هو على الأسطح معطف البوليسترين مع ICAM-1 لتكون بمثابة بروابط لخلية T LFA-1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحلول التالية: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل الطلاء عن طريق إعادة التعليق المؤتلف ICAM-1 مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) حل (137 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 2.7 ملي بوكل، 10 ملي نا 2 هبو 4، 2 ملي KH 2 PO 4، ودرجة الحموضة 7.4) المخصب مع الكالسيوم (1 ملم و CaCl 2) والمغنيسيوم (2 نانومتر MgCl 2). تأكد من أن تركيز النهائي من ICAM-1 هو 10 ميكروغرام / مل، مصنوعة من محلول المخزون 0.7 ملغ / مل ويوضع في الفريزر -80 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل التصاق من خلال إثراء برنامج تلفزيوني مع 0.5٪ الإنسان (أو البقري) ألبومين المصل (هسا / BSA)، 2 مم MgCl 2، و 1 مم CaCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل غسل بإضافة 2 ملي MgCl 2 و 1 مم CaCl 2 إلى برنامج تلفزيوني. تدفئة جميع الحلول إلى 37° C قبل الاستخدام. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل 24 بئرا مع 50 ميكرولتر من محلول الغسيل. وسوف تشمل هذه الآبار غير مغسولة، (سلطة النقد الفلسطينية معاملة الخلايا) إيجابية، وسلبية (الآبار غير المصقول) الضوابط. لكل حالة تعيين ثلاثة على الأقل من الآبار (ثلاث نسخ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من محلول الطلاء إلى كل بئر. لا تضيف إلى آبار المراقبة غير المصقول. احتضان لمدة ساعة واحدة داخل الحاضنة 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح الحل طلاء بلطف، دون السماح للطرف للمس الجزء السفلي من الآبار. يغسل مرة واحدة مع 50 ميكرولتر من محلول الغسيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من حل التصاق واحتضان صفيحة ميكروسكوبية لساعة واحدة داخل الحاضنة 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بلطف ويغسل مرة واحدة مع 50 ميكرولتر حل غسل. استخدام لوحة في نفس اليوم، ومع ذلك فمن الممكن أن يبقيه عند 4 درجات مئوية خلال الليل، واستخدامها في اليوم التالي. </li></ol> 2. تي خلية عزل من الدم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة T كوكتيل إثراء خلية الإنسان على 50 ميكرولتر / مل سو الدم الكامل (على سبيل المثال لمدة 3 مل من تخثر (الهيبارين، EDTA أو سيترات) الدم الكامل، إضافة 150 ميكرولتر من الكوكتيل). تخلط جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل إضافة 3 مل من الدم المعالج وحجم مساو من برنامج تلفزيوني (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم) المخصب مع 1٪ D-جلوكوز في درجة حرارة الغرفة. المزيج بلطف مع ماصة باستور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 15 مل Ficoll-PLUS Paque إلى أنبوب الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طبقة بعناية 6 مل مخففة عينة من الدم على المدى المتوسط ​​لمفاوية العزلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 20 دقيقة عند 20 درجة مئوية مع كسر قبالة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم قبالة الطبقة العليا باستخدام ماصة باستير نظيفة، وترك طبقة الخلايا اللمفاوية دون عائق في واجهة. الطبقة العليا من البلازما يمكن حفظها لاستخدامها لاحقا. باستخدام ماصة باستير نظيفة نقل طبقة الخلايا اللمفاوية إلى أنبوب الطرد المركزي نظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 3 مجلدات (9 مل) من برنامج تلفزيوني إلى الخلايا الليمفاوية. تعليق الخلايا بلطف جدرانالجناح لهم داخل وخارج ماصة باستور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق عند 20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف. وينبغي الآن علقت الخلايا الليمفاوية في المناسبة المتوسطة إلى التطبيق. نقل الخلايا إلى ثقافة قارورة T-75 في 20 مل 1640 RPMI وسائل الإعلام التي تحتوي على 10٪ FBS، 1٪ البنسلين / الستربتوميسين. </li></ol> 3. إعداد خلايا ملاحظة: ثمة شرط أساسي هو للخلايا التي يتم وسمها مع كاشف الفلورسنت. في هذا البروتوكول استخدام كربوكسي فلوريسئين succinimidyl استر (CFSE)، بروتين فلوري ولكن الأخضر (GFP) الخلايا معربا هي بديل مقبول. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العد 2.4 × 10 6 خلايا T (1 × 10 5 لكل بئر) باستخدام عدادة الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الخلايا في وسائل الإعلام التي تفتقر إلى الثقافة المصل (التجويع المصل). احتضان الخلايا لمدة 2 ساعة في الحاضنة 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق (400 x ج). نضح وسائل الإعلام وResuspend في 1 مل PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة CFSE في 1:1،000 التخفيف (الأسهم المبذولة ل5 ملم). تغطية عن الضوء واحتضان لمدة 8 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف رد الفعل من خلال إضافة 10 مل من 37 درجة مئوية في برنامج تلفزيوني وتدور في 400 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق بيليه الخلية مع 1.2 مل من محلول التصاق قبل حرارة (1 × 10 5 خلايا لكل 50 ميكرولتر). </li></ol> 4. تحفيز خلايا ملاحظة: من أجل بدء التصاق، يجب تحفيز الخلايا. في التجربة التالية يتم تحفيز الخلايا عن طريق استخدام أجسام مضادة TCR مكافحة CD3 يشابك، ولكن للذوبان SDF-1 يمكن أن تكون بمثابة بديل. اعتمادا على الهدف من التجارب، ويمكن إضافة مختلف الكواشف الدوائية قبل أو خلال التحفيز لدراسة تأثير ذلك على التصاق الخلوية. Phorbol ميريستات خلات (سلطة النقد الفلسطينية) هو استر phorbol مشابه هيكليا للثاني الجلسرين رسول diacyl (DAG) وينشط كيناز متعددة ولق المصب في TCR (أساسا بروتين كيناز C)؛ هنا يتم استخدامه كعنصر تحكم إيجابية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدفئة صفيحة ميكروسكوبية إلى 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقسيم الخلايا في 8 فارغة 1.5 مل أنابيب (150 ميكرولتر في كل أنبوب)، أنبوب واحد لكل حالة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج الخلايا تبعا لذلك: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحفيز أنبوب واحد مع سلطة النقد الفلسطينية في 10 نانوغرام / مل لخدمة التحكم إيجابية. تبقي ثلاثة أنابيب غير المعالجة، لتكون بمثابة الرقابة على التحفيز (&quot;لا التحفيز&quot;)، ومراقبة التحميل غير مغسولة (&quot;لا يغسل&quot;)، والسيطرة على ICAM-1 طلاء (&quot;غير المصقول&quot;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحفيز أربعة أنابيب مع تركيزات مختلفة من الأجسام المضادة لمكافحة CD3 (0.1، 1، 5، و 10 ميكروغرام / مل). الاستمرار في الخطوة التالية دون تأخير. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة 50 ميكرولتر من مزيج خلية فارغة في كل حفز جيدا. العدد النهائي للخلايا لكل بئر هو 1 × 10 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع صفيحة ميكروسكوبية في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. ملاحظة: بعض خطوط الخلايا T تتطلب أقصر stimula<html> وقت نشوئها. خلال هذا الوقت، فإن الخلايا يستقر في قاع الآبار والتمسك بروابط الهدف. </li></ol> 5. تجرف الخلايا غير ملتصقة ملاحظة: الهدف من هذه الخطوة هو إزالة الخلايا التي لم تكن قادرة على تشكيل اتصالات مع ضيق السطوح المغلفة يجند. استخدام ماصة الأقنية لهذه الخطوة من أجل ضمان أن نفس القوى المادية يتم تطبيقها على جميع الآبار. فمن المهم للحفاظ على آبار المراقبة المشار إليه غير مغسولة للمساعدة في حساب نسبة الخلايا الملتصقة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 150 ميكرولتر من حل التصاق الحارة إلى كل الآبار. يهز لوحة بلطف لبضع ثوان قبل إزالة المتوسطة من الآبار. لا تلمس الجزء السفلي من الآبار مع النصائح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر هذه الخطوة ثلاث مرات. تغيير اتجاه ماصة عندما pipetting لعازلة داخل وخارج. </li></ol> 6. تحديد نسبة خلايا منتسب _content &quot;&gt; ملاحظة: في هذه الخطوة يتم استخدام قارئ لوحة الفلورسنت لقياس كثافة الفلورية داخل كل بئر كثافة في علاقة مباشرة مع عدد من الخلايا الملتصقة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على قارئ لوحة. فتح برنامج قارئ لوحة بالنقر على أيقونة الاختصار على سطح المكتب. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من القائمة &quot;المهام&quot; فوق &quot;جديد&quot; لإنشاء بروتوكول جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من القائمة &quot;إجراءات&quot; اختيار &quot;اقرأ&quot; الخيار. انقر على زر &quot;كثافة نيون&quot; وضرب &quot;موافق&quot; علامة التبويب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من القائمة المنسدلة حدد &quot;الإثارة الطول الموجي 485&quot; و &quot;528 الطول الموجي الانبعاثات&quot;. ضرب &quot;موافق&quot; علامة التبويب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في &quot;البصرية&quot; القائمة الخيار حدد &quot;أسفل&quot; وضرب &quot;موافق&quot; علامة التبويب. العودة إلى قائمة &quot;الأعمال&quot; وضبط درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية، وانقر على زر &quot;موافق&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج صفيحة ميكروسكوبية في قارئ لوحة وانقر على زر &quot;تشغيل&quot;. وسيتم تصدير النتيجة في جداول البيانات إكسل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب النسبة المئوية من الخلايا الملتصقة باستخدام الصيغة التالية: نسبة الخلايا الملتصقة = (متوسط ​​كثافة الفلورسنت قراءة في الآبار غسلها) / (متوسط ​​كثافة الفلورسنت قراءة في الخلايا غير مغسولة) × 100٪. </li></ol>

<ol>
	<li>Dustin, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membranes+as+messengers+in+T+cell+adhesion+signaling.">Membranes as messengers in T cell adhesion signaling.</a> Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).</li><li>Mor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTPases+and+LFA-1+reciprocally+modulate+adhesion+and+signaling.">GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling.</a> Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).</li><li>Rose, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+modulation+and+signaling+in+leukocyte+adhesion+and+migration.">Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration.</a> Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).</li><li>Alon, R., Feigelson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine-triggered+leukocyte+arrest:+force-regulated+bi-directional+integrin+activation+in+quantal+adhesive+contacts.">Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts.</a> Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).</li><li>Griffith, J. W., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cells+in+motion:+migrating+toward+improved+therapies.">Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies.</a> Eur J Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+molecules+and+actin+cytoskeleton+at+immune+synapses+and+kinapses.">Cell adhesion molecules and actin cytoskeleton at immune synapses and kinapses.</a> Curr Opin Cell Biol. 19 (5), 529-533 (2007).</li><li>Springer, T. A., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+inside-out+signaling+and+the+immunological+synapse.">Integrin inside-out signaling and the immunological synapse.</a> Curr Opin Cell Biol. 24 (1), 107-115 (2012).</li><li>Mor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D1+regulates+lymphocyte+adhesion+via+upregulation+of+Rap1+at+the+plasma+membrane.">D1 regulates lymphocyte adhesion via upregulation of Rap1 at the plasma membrane.</a> Mol Cell Biol. 29 (12), 3297-3306 (2009).</li><li>Bivona, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1+up-regulation+and+activation+on+plasma+membrane+regulates+T+cell+adhesion.">Rap1 up-regulation and activation on plasma membrane regulates T cell adhesion.</a> J Cell Biol. 164 (3), 461-470 (2004).</li><li>Zeltzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diminished+adhesion+of+CD4++T+cells+from+dialysis+patients+to+extracellular+matrix+and+its+components+fibronectin+and+laminin.">Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin.</a> Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).</li><li>Bhattacharyya, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+adhesion+to+immobilized+vitronectin+and+Fc+epsilon+RI+cross-linking+cause+enhanced+focal+adhesion+kinase+phosphorylation+in+murine+mast+cells.">Both adhesion to immobilized vitronectin and Fc epsilon RI cross-linking cause enhanced focal adhesion kinase phosphorylation in murine mast cells.</a> Immunology. 98 (3), 357-362 (1999).</li><li>Dustin, M. L., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+signaling+clusters+in+the+immune+synapse.">Receptor signaling clusters in the immune synapse.</a> Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

هناك عدة فحوصات لدراسة الإشارات إلى LFA-1 وتفعيل الخلايا التائية التصاق 12. التدفق الخلوي يستخدم لقياس LFA-1 على تقارب في الخلايا الحية باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة التي تربط بشكل انتقائي لمحني إما تمديد أو LFA-1. واحدة من القيود المفروضة على هذه الطريقة هو أنه لا يأخذ في الاعتبار الطمع ولل integrins &#39;. المقايسات الهجرة هي أدوات مفيدة لكنها قياس الهجرة، وليس التصاق تافه عند نقطة زمنية محددة. نماذج الماوس لدراسة الخلايا اللمفاوية T الهجرة (على سبيل المثال نموذج فرط الحساسية الجلدية) هي ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية، ولكن الاستفادة من هذه النماذج هو سياقاتها ومعقدة لتنفيذه. القوة الرئيسية للمقايسة التصاق ثابت الموصوفة هنا هو قدرته على قياس كل من الطمع وتقارب بطريقة بسيطة. ميزة أخرى لهذا الأسلوب هو قدرتها على اكتشاف عدد صغير من الخلايا بسرعة وبدقة. بالمقارنة مع الطرق الأخرى، هو أسهل بكثير لmanipulate الخلايا وتعاملهم مع الكواشف المختلفة في مقايسة وظيفية كما هو وصفنا. علاوة على ذلك، يتم عد الخلايا الملتصقة بموضوعية مع قارئ لوحة، والتحيز القضاء المرتبطة التهم اليدوي. هذه الطريقة يمكن استخدامها لفحص تأثير العقاقير أو متعددة الجينات التلاعب في عملية الالتصاق. ولكن هذه التقنية ليست خالية من القيود. ومن بين نقاط الضعف المحتملة هو حقيقة أن نسبة الخلايا الملتصقة هو العدد النسبي، والتي قد تختلف من تجربة إلى أخرى. ضعف آخر هو حقيقة أن الخلايا الليمفاوية الانفجار لا يمكن استخدامها، وهذه يجب أن تكون معزولة حديثا. علاوة على ذلك، الدراسات التصاق مع الخلايا تعافى من خلايا الدم المحيطية المجمدة ليست متسقة. من المهم الإشارة إلى أن سلطة النقد الفلسطينية يجب أن تعمل باستمرار، ونحن نوصي باستخدام ذلك في كل تجربة. A إيجابية والسيطرة السلبية هي الخطوات الأولى في استكشاف تجارب ناجحة. في حالة عدم وجودزيادة التصاق الخلايا في حفز، يجب فحص تركيز يجند الهدف الذي يغطي الآبار. بالإضافة هو مطلوب منها للتحقق من صحة أن أكثر من 95٪ من خلايا قابلة للحياة، وفي حالة وجود خط الخلية، يجب أن تحسب مرحلة نموها. في حالة تقلب كبير في حالة نفسه، فمن المستحسن لاستخدام أكثر من ثلاثة آبار متطابقة (أكثر من ثلاث نسخ). لكي نقدر هذا الاختبار فإنه من المفيد أن نفهم أن بعض الخطوات في البروتوكول مثل فترة حضانة وعدد الخلايا المصنف يجب أن تكون موحدة بين جميع الظروف. الفروق الصغيرة في فترة حضانة قد يؤدي هو قياسات غير دقيقة. بل هو أيضا أمر حيوي لقسامة بالضبط نفس العدد من الخلايا هو كل بئر. التطبيقات المستقبلية لهذه التقنية، وتحسين دقتها ستكون النسخة الآلي التي من شأنها تحميل الخلايا وإجراء يغسل بطريقة أكثر موضوعية. بالإضافة إلى ذلك، سوف إصدار الآلي تمكننالأداء شاشات واسعة النطاق.

تي اللمفاويات التصاق هو عملية أساسية في الاستجابة المناعية 1. هو مطلوب منها لT تفاعل الخلايا مع الخلايا البطانية تزيين جدران الشعيرات الدموية، لمسح مستضد تقديم الخلايا (APC) داخل الغدد الليمفاوية، وتشكيل نقاط الاشتباك العصبي المناعية (IS) مع الخلايا المستهدفة 2. هذه المتطلبات وظيفيا ومتميزة kinetically. تتكون عملية التسرب من الخلايا الليمفاوية chemoattraction، المتداول، التصاق شركة، والتهجير. الانتقال من المتداول لشركة التصاق خلايا T يتطلب للرد على بروتين G جانب إشارة مستقبلات بسرعة. هذا الرد ينتج التفاعل يجند إنتغرين التي تبطئ والاعتقالات الخلية المتداول 3. تغيير فوري في الطمع إنتغرين يتوسط هذه العملية. يتطلب الهجرة التفاعلات betweenTcells ديناميكية والخلايا البطانية مع تشكيل الالتصاقات في &quot;الواجهة الأمامية&quot; والكسر من التصاقات في &quot;النهاية الخلفية&quot;مع فاصل من حوالي دقيقة واحدة بين تشكيل وكسر 4. ويشكل IS inminutes، ولكن يجب أن يظل سليما لساعات 6. ومن المثير للاهتمام، واحدة جزيء التصاق، وظيفة الخلايا اللمفاوية أفراد الأسرة إنتغرين المستضد المرافق (LFA) - 1، أمر ضروري لجميع هذه العمليات 5. LFA-1 تتوسط الالتصاق من خلال التفاعل مع عدد من أعضاء الفصيلة المناعي. يجند معظم درس على نطاق واسع وفقا لأعلى تقارب إلى LFA-1 هو جزيء التصاق بين الخلايا (ICAM) -1. الخلايا الليمفاوية المنتشرة غير تنشيط تعبير عن انخفاض تقارب LFA-1 على سطح الخلية، وبالتالي غير قادر على الانضمام إلى السطوح ICAM-1-المغلفة. LFA-1 تقارب هو متغير وينظم العديد من الأحداث يشير مثل البروتين يقترن G تنشيط مستقبلات، والتحفيز خلوى، والإشارات بوساطة مستقبلات الخلايا التائية (TCR). الناتج شكل تقارب عالية من LFA-1 ينقل تنشيط الخلايا إلى الفضاء خارج الخلية رالتفاعلات hrough مع ICAM-1. ويطلق على هذا المسار من الداخل إلى الخارج مما يشير 7. وبالمثل، من خلال إشارات LFA-1 من الفضاء خارج الخلية يسمى خارج في الإشارة. في داخل الخلايا مما يشير شلالات تشارك في الداخل إلى الخارج وخارجها في إشارة هي نقطة تركيز رئيسية في الأبحاث الحالية. برزت في الآونة الأخيرة GTPase Rap1 الصغيرة كعنصر رئيسي من الداخل إلى الخارج مما يشير إلى أن من الشائع أن كلا ربط TCR ويشير خلوى 8. وسلط الضوء على الدور الحاسم للRap1 في تفعيل إنتغرين من اكتشاف أن overexpression من Rap1 يحفز تعتمد على إنتغرين التصاق الخلايا T، في حين تم منع التصاق الخلايا التائية عن طريق التعبير عن المهيمنة Rap1 السلبية 9. وقد تم إنجاز هذا التقدم في فهمنا للتنظيم إنتغرين بواسطة Rap1 باستخدام الأدوات في المختبر. من بينها هو مقايسة التصاق ثابت الموصوفة هنا. الهدف العام من هذا الأسلوب هو دراسة Tالإلتصاق الخلية إلى ICAM-1 الأسطح المطلية. وبشكل أكثر تحديدا، يتم استخدامه لقياس موضوعي وقياس LFA-1 تقارب نحو بروابط مضادة في الخلايا الحية في الوقت الحقيقي، في ظل ظروف مختلفة. يستخدم هذا الأسلوب الآبار البوليسترين المغلفة مع ICAM-1 لتقليد السطوح الخلوية أن الخلايا T التفاعل معه. وكانت العديد من فحوصات التصاق الخلية T ثابت سبق وصفها معقدة تجريبيا. هذه المقايسات اللازمة لفي كثير من الأحيان الخلايا التائية ليكون المسمى بالإشعاع، استخدمت خلايا القرنية البقري مثقف لإنشاء المصفوفة خارج الخلية والركيزة لالتصاق الخلايا التائية، أو دعا لغير الفسيولوجية تحفيز الخلايا التائية على مدى فترة طويلة لتعزيز التصاق الخلية T 10. استخدام القياس فلوروميتريك لتحديد خلايا T بعد الحضانة التصاق هي طريقة أكثر حساسية ودقة من القياس الكمي بالمقارنة مع التدفق الخلوي والفحص المجهري، كما تستخدم في العديد من أنظمة الفحص الأخرى 11. بالإضافة إلى ذلك، microscop خلية واحدةلا يسمح تحليل جيم من إنتغرين توطين ل، تحليل واسع النطاق السكان مقرها في بنفس طريقة قياس فلوروميتريك. في حين أن التنشيط محددة للدولة LFA-1 الأضداد المتاحة تجاريا، هذه الأجسام المضادة توفر حساسية منخفضة نسبة إلى الطريقة الموضحة هنا. والميزة الرئيسية على التقنيات البديلة هو بساطته والقدرة على دراسة ظروف تجريبية متعددة في نفس الوقت. عند النظر في هذا الأسلوب من أجل تطبيق معين، ينبغي للمرء أن يأخذ في الاعتبار أن الخلايا T يجب أن يكون محددا سلبيا، طازجة معزولة، والمسمى مع علامة فلوري.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="828">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Plate reader</td>
			<td style="width:160px;">BioTek&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Synergy H1 Hybrid</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Multichannel pipette</td>
			<td style="width:160px;">Fisher</td>
			<td style="width:136px;">21-377-829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">96-well microplate with optical bottom</td>
			<td style="width:160px;">Corning Costar</td>
			<td style="width:136px;">3603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Recombinant ICAM-1</td>
			<td style="width:160px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:136px;">ADP4-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Anti-CD3 antibodies</td>
			<td style="width:160px;">Ancell</td>
			<td style="width:136px;">144-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">PMA</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">79346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">BSA</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">CFSE</td>
			<td style="width:160px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:136px;">C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">RPMI</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">DPBS containing calcium and magnesium</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;">14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Peripheral lymphocytes</td>
			<td style="width:160px;">e.g. mouse or human</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>499609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Open Gen 5 software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Version 2.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>71-7167-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15 and 50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>352099, 352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable plastic Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T-75 culture flasks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-754-1366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RosetteSep T cell enricment kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>15061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

static adhesion assay for the study of integrin activation in t lymphocytes

مطلوب تي اللمفاويات التصاق لعدة وظائف الخلايا التائية، بما في ذلك الهجرة إلى مواقع الالتهاب وتشكيل نقاط الاشتباك العصبي مع الخلايا المناعية تقديم المستضد. خلايا T إنجاز التصاق التنظيم من خلال التحكم في خصائص لاصقة من لل integrins، فئة من جزيئات التصاق الخلية تتكون من أزواج من البروتينات عبر الغشاء heterodimeric التي تتفاعل مع الجزيئات المستهدفة على الخلايا شريك أو المصفوفة خارج الخلية. أبرز الخلايا التائية إنتغرين هي وظيفة الخلايا اللمفاوية المرتبطة مستضد (LFA) -1، وتتألف من وحدات فرعية αL وβ2، هدفها هو جزيء التصاق الخلايا (ICAM) -1. قدرة الخلايا التائية للسيطرة على التصاق مستمد من القدرة على تنظيم الدول تقارب لل integrins الفردية. يصف من الداخل إلى الخارج إشارات العملية التي الإشارات داخل الخلية يسبب المجالات الخارجية لل integrins لتولي دولة تفعيلها. ويستند الكثير من معرفتنا لهذه الظواهر المعقدة على الآليةالدراسات التي أجريت في نظم مبسطة في نموذج المختبر. تي اللمفاويات التصاق مقايسة الموصوفة هنا هو أداة ممتازة تسمح خلايا T التمسك استهداف جزيئات، في ظل ظروف ثابتة، ومن ثم يستخدم قارئ لوحة الفلورسنت لتحديد الإلتصاق. وكان هذا الاختبار مفيدا في تحديد المواد المحفزة أو المثبطة التصاق التي تعمل على الخلايا الليمفاوية، فضلا عن تميز الأحداث يشير المعنية. على الرغم من وصفها هنا لLFA-1 - ICAM-1 التصاق بوساطة؛ هذا الاختبار يمكن تكييفها بسهولة للسماح لدراسة التفاعلات الأخرى لاصقة (مثل VLA-4 - فبرونيكتين).

وفيما يلي مثال على مقايسة التصاق باستخدام خلايا T الأولية حفز مع تركيزات مختلفة من الأجسام المضادة لمكافحة CD3. فمن المفيد معرفة مضان من الخلايا غير مغسولة (أي التحميل المجموع). خلايا Unstimulated بمثابة سيطرة سلبية وسلطة النقد الفلسطينية الخلايا المعالجة هي مراقبة إيجابية للأجسام المضادة للCD3. الخلايا مطلي في الآبار غير المصقول بمثابة الرقابة على ICAM-1. في تجربة نموذجية النسبة المئوية للخلايا ملتصقة تعامل سلطة النقد الفلسطينية ما بين 40٪ إلى 50٪ في حين بلغت نسبة الخلايا unstimulated ما بين 5٪ إلى 10٪. طريقة بديلة لقياس الإلتصاق الخلوي هو عن طريق حساب الزيادة أضعاف كثافة الفلورية في كل حالة على مدى تلك الخلايا unstimulated. ويبين الجدول 1 كثافة مضان CFSE المسمى خلايا T الأولية حفز مع جرعات مختلفة من الأجسام المضادة المقاومة للذوبان CD3 ومطلي على ICAM-1 الآبار المغلفة. الشكل يبين 1 ايم ممثلالأعمار من تجربة مماثلة. وقد تم اختيار الخلايا سلبا من الدم المحيطي. بعد التجويع المصل لمدة 2 ساعة، وصفت 2.4 × 10 6 خلايا مع CFSE تليها التحفيز مع ذوبان الأجسام المضادة للCD3 بتركيزات مختلفة. كانت مطلية الخلايا حفز في ICAM-1 الآبار المغلفة والمحتضنة لمدة 15 دقيقة في الظلام. بعد الحضانة تم غسلها الخلايا غير ملتصقة بها ثلاث مرات وتم قياس كثافة مضان باستخدام قارئ لوحة في 485 نانومتر. سلطة النقد الفلسطينية المعالجة واستخدمت الخلايا unstimulated والضوابط. لاحظ أن العمود الأول (1A-1C) يحتوي على خلايا التي لم تغسل (مجموع التحميل وعلى سبيل المثال 100٪). ويبين الشكل 2 في المئة من التصاق الخلايا التائية كما حسبت على أساس شدة الفلورسنت الواردة في الجدول 1. مقابل كل حالة تم حساب متوسط ​​كثافة الآبار الثلاث (ثلاث نسخ) وتحويلها إلى النسبة المئوية النسبية من مجموع الخلايا المحملة ( <stroنانوغرام&gt; الجدول 1؛ العمود 1). تم حساب الخطأ المعياري للمتوسط ​​لكل حالة. كما هو مبين في الشكل، ونسبة الخلايا الملتصقة أكبر مع تركيز أعلى من الأجسام المضادة لمكافحة CD3 المستخدمة في التحفيز. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> لا تغسل </td><td> غير المصقول </td><td> Unstimulated </td><td> سلطة النقد الفلسطينية </td><td> مكافحة CD3 0.1 ميكروغرام / مل </td><td> مكافحة CD3 1 ميكروغرام / مل </td><td> مكافحة CD3 5 ميكروغرام / مل </td><td> مكافحة CD3 10 ميكروغرام / مل </td></tr><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> A </td><td> 89652 </td><td> 611 </td><td> 5219 </td><td> 45873 </td><td> 8964 </td><td> 20157 </td><td> 37972 </td><td> 37972 </td></tr><tr><td> B </td><td> 90248 </td><td> 320 </td><td> 6049 </td><td&gt; 44698 </td><td> 7568 </td><td> 25486 </td><td> 32549 </td><td> 32549 </td></tr><tr><td> C </td><td> 88321 </td><td> 409 </td><td> 5456 </td><td> 42697 </td><td> 8542 </td><td> 24568 </td><td> 32892 </td><td> 3289 </td></tr></tbody></table> الجدول 1. القيم شدة الإسفار من CFSE المسمى خلايا T الأولية حفز مع تركيزات مختلفة من الأجسام المضادة المقاومة للذوبان CD3. الخلايا المقطوع حديثا تم تجويع المصل لمدة ساعتين والمسمى مع CFSE في تركيز 5 ميكرومتر في وقت لاحق. المقبل، وحفز الخلايا مع مستوى منخفض (0.1 ميكروغرام / مل) والمتوسطة (1 ميكروغرام / مل)، وارتفاع (5 ميكروغرام / مل)، وعالية جدا (10 ميكروغرام / مل) تركيزات قابلة للذوبان أجسام مضادة لمكافحة CD3 و1 كانت مطلية × 10 5 خلايا في كل بئر (المغلفة مسبقا مع ICAM-1). بعد 15 دقيقة تم إزالة الخلايا غير ملتصقة ثلاثة يغسل المسلسل. تم قياس عدد الخلايا الملتصقة مع قارئ لوحة كما قhown في هذا الجدول. آبار 1A-1C: الخلايا غير مغسولة؛ 2A-2C: الآبار غير المصقول؛ 3A-3C: الخلايا unstimulated؛ 4A-4C: الخلايا حفز مع 10 نانوغرام / مل سلطة النقد الفلسطينية؛ 5A-5C: الخلايا حفز مع جرعة منخفضة الأجسام المضادة لمكافحة CD3؛ 6A-6C: الخلايا حفز مع جرعة متوسطة من الأجسام المضادة لمكافحة CD3؛ 7A-7C: الخلايا حفز مع جرعة عالية الأجسام المضادة لمكافحة CD3؛ 8A-8C: الخلايا حفز مع جرعة عالية جدا الأجسام المضادة لمكافحة CD3. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51646/51646fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51646/51646fig1.jpg" /> الرقم 1. صور من خلايا تي الأولية حفز مع تركيزات مختلفة من الأجسام المضادة المقاومة للذوبان CD3. خلايا المقطوع حديثا تم تجويع المصل لمدة ساعتين والمسمى مع CFSE في تركيز 5 ميكرومتر في وقت لاحق. المقبل، وحفز الخلايا مع سلطة النقد الفلسطينية (10 نانوغرام / مل) أو تركيزات مختلفة من الأجسام المضادة لمكافحة CD3 (0.1، 1، 5، و 10 ميكروغرام / مل) ومطلي علىICAM-1 المغلفة السطوح. وقد أخذت صور مع ممثل زايس 700 المجهري متحد البؤر باستخدام 20X التكبير. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51646/51646fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51646/51646fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51646/51646fig2.jpg" /> الشكل 2. تحفيز خلايا T مع جرعة عالية مضادة للCD3 الأجسام المضادة النتائج في زيادة التصاق. التمثيل رسوم بيانية للفي المئة من التصاق الخلايا التائية المحسوبة من هو مبين في الجدول رقم 1. تم حساب متوسط ​​نسبة الخلايا الملتصقة نسبة إلى غير مغسولة الخلايا التي تمثل 100٪. رسوم بيانية تقديم نتائج (يعني ± SEM) من لا يقل عن 3 آبار. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51646/51646fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء أنقر</a>ك هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Watch this Scientific Journal Video about Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes at JoVE.com

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

ثابت التصاق الاختبار هو أداة قوية التي يمكن استخدامها لنموذج التفاعلات بين الخلايا الليمفاوية T وأنواع الخلايا الأخرى. يتم إنشاؤها التفاعلات عن طريق حقن خلايا T وصفت في الآبار المغلفة مع جزيئات الالتصاق، في حين يتم استخدام قارئ لوحة لتحديد عدد الخلايا الملتصقة التالية يغسل المسلسل.

ثابت التصاق الفحص لدراسة إنتغرين تنشيط الخلايا اللمفية تي في

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

static-adhesion-assay-for-study-integrin-activation-t

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Unit 1

Cell-Matrix Interactions

SCIENTISTS IN ACTION

15.9K Views.  New York University School of Medicine.  ثابت التصاق الاختبار هو أداة قوية التي يمكن استخدامها لنموذج التفاعلات بين الخلايا الليمفاوية T وأنواع الخلايا الأخرى. يتم إنشاؤها التفاعلات عن طريق حقن خلايا T وصفت في الآبار المغلفة مع جزيئات الالتصاق، في حين يتم استخدام قارئ لوحة لتحدي?...

Video: Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

الفحص في المختبر من الالتصاق الجرثومي على الخلايا الظهارية الثدييات

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

إدخال إجهاد القص في دراسة الالتصاق الجرثومي

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of malignancies 1. CTLs can recognize malignant cells by interacting tumor antigens with the T cell receptors (TCR), and release cytotoxins as well as cytokines to kill malignant cells. It is known that less-differentiated and central-memory-like (termed highly reactive) CTLs are the optimal population for ACT-based immunotherapy, because these CTLs have a high proliferative potential, are less prone to apoptosis than more differentiated cells and have a higher ability to respond to homeostatic cytokines 2-7. However, due to difficulties in obtaining a high number of such CTLs from patients, there is an urgent need to find a new approach to generate highly reactive Ag-specific CTLs for successful ACT-based therapies.
TCR transduction of the self-renewable stem cells for immune reconstitution has a therapeutic potential for the treatment of diseases 8-10. However, the approach to obtain embryonic stem cells (ESCs) from patients is not feasible. Although the use of hematopoietic stem cells (HSCs) for therapeutic purposes has been widely applied in clinic 11-13, HSCs have reduced differentiation and proliferative capacities, and HSCs are difficult to expand in in vitro cell culture 14-16. Recent iPS cell technology and the development of an in vitro system for gene delivery are capable of generating iPS cells from patients without any surgical approach. In addition, like ESCs, iPS cells possess indefinite proliferative capacity in vitro, and have been shown to differentiate into hematopoietic cells. Thus, iPS cells have greater potential to be used in ACT-based immunotherapy compared to ESCs or HSCs.
Here, we present methods for the generation of T lymphocytes from iPS cells in vitro, and in vivo programming of antigen-specific CTLs from iPS cells for promoting cancer immune surveillance. Stimulation in vitro with a Notch ligand drives T cell differentiation from iPS cells, and TCR gene transduction results in iPS cells differentiating into antigen-specific T cells in vivo, which prevents tumor growth. Thus, we demonstrate antigen-specific T cell differentiation from iPS cells. Our studies provide a potentially more efficient approach for generating antigen-specific CTLs for ACT-based therapies and facilitate the development of therapeutic strategies for diseases.

Generation of T lymphocytes from induced pluripotent stem (iPS) cells gives an alternative approach of using embryonic stem cells for T cell-based immunotherapy. The method shows that by utilizing either in vitro or in vivo induction system, iPS cells are able to differentiate into both conventional and antigen-specific T lymphocytes.

توجه التمييز بين الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة نحو الخلايا اللمفية تي

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

كمي<em&gt; في المختبر</em&gt; الفحص لقياس التصاق العدلات إلى تنشيط الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الأساسية بموجب الشروط ثابت

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

العزلة والتمايز TH17 من السذاجة CD4 T الخلايا اللمفاوية

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

تدفق التصاق الفحص لدراسة توظيف الكرية البيضاء لالكبدي الإنسان جيبية البطانة Endothelium تحت ظروف إجهاد القص

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

غرفة تدفق العدلات الإنسان التصاق الفحص

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

في المختبر والمجراة نموذج لدراسة التصاق البكتيريا إلى سفينة ستريت تحت ظروف التدفق

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to the palatine tonsils situated at the lateral walls of the oral part of the pharynx. Surgically removed palatine tonsils provide a convenient accessible source of B and T lymphocytes to study the interplay between foreign pathogens and the host immune system. This video protocol describes the dissection and processing of surgically removed human palatine tonsils, followed by the isolation of the individual B and T cell populations from the same tissue sample. We present a method, which efficiently separates tonsillar B and T lymphocytes using an antibody-dependent affinity protocol. Further, we use the method to demonstrate that human adenovirus infects specifically the tonsillar T cell fraction. The established protocol is generally applicable to efficiently and rapidly isolate tonsillar B and T cell populations to study the role of different types of pathogens in tonsillar immune responses.

Palatine tonsils are a rich source of B and T lymphocytes. Here we provide an easy, efficient and rapid protocol to isolate B and T lymphocytes from human palatine tonsils. The method described has been specifically adapted for studies of the viral etiology of tonsil inflammation known as tonsillitis.

بروتوكول عزل فعال للاللمفاوية البائية والتائية من بلاطي اللوزتين الإنسان

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

فحص من التصاق تحت إجهاد القص لدراسة تي اللمفاويات-التصاق جزيء التفاعلات

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...