وأيد هذا العمل من قبل جمعية الألمانية للبحوث (DFG)، ونحن نود أن نشكر أييلي تسيديكي Taddese للدعم التقني.

1. إعداد الإبر الزجاج (الشكل 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الزجاج الشعيرات الدموية مع 0.75 مم لإعداد الإبر الحقن (الشكل 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الزجاج الشعرية في مجتذب الإبرة وسحب الإبرة مع المعلمة التالية: قيمة دورة التدفئة: 463؛ سحب قيمة دورة: 230؛ السرعة: 150 ميللي ثانية؛ الوقت: 150 ميللي ثانية (الشكل 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كسر الزجاج الشعرية سحبت مع ملاقط ساعاتي لإنتاج إبرة قطرها 20 ميكرومتر تحت المجسام مع العدسة ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مخرطة مع المبللة عجلة الغزل المطاط لشحذ الإبرة وتنتج 20 ميكرون شطبة (أرقام 1C و1D). ملاحظة: شارب، والإبر مشطوف تحسين سهولة الإدراج في البطين، وبالتالي التقليل من الأضرار التي لحقت الأنسجة والعضلات مثقبة تسمح لختم بعد إزالة الإبرة (أرقام 1E-G). </li></ol> 2. Preparأوجه من الحل Morpholino <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الأسهم morpholino عن طريق إذابة morpholino مجفف بالتجميد في 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) إلى تركيز النهائي من 7.5 ملم. [راجع إرشادات الشركة المصنعة للحصول على التفاصيل (الجدول مواد)]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل الحقن morpholino عن طريق خلط 2.5 ميكرولتر حل الأسهم morpholino (7.5 ملم) مع 2.8 ميكرولتر إندو بورتر محلول المخزون (1 ملم) (انظر الجدول مواد) لتركيز النهائي من 3.5 ملم و 0.5 ملم morpholino إندو بورتر. </li></ol> 3. إعداد حقن Morpholino (الشكل 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل إبرة الزجاج مشطوف مع 5 ميكرولتر من هذا الحل باستخدام micropipette مع 10 ميكرولتر ماصة microloader طرف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ادخال الإبرة الزجاج في ماسك الإبرة من مياداة مجهرية متصلة مضخة هوائية بيكو (أرقام 2A-C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع حامل إبرة بجانب المجهر بحيث الإبرة الاحتياجات فقطيمكن نقلها في اتجاه واحد إلى مستو أدخله في البطين في القلب من اليرقة (الشكل 2A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط زاوية للحقن بنحو 45 درجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين قيم microinjector على النحو التالي: عقد الضغط: 20 £ لكل بوصة مربعة (رطل)؛ طرد الضغط: 15 رطل؛ 100 ميللي ثانية مجموعة من تبوب، قيمة الفترة من 1.9 (10.9 ميللي ثانية يناظر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تذوب الاغاروز في برنامج تلفزيوني 1X باستخدام الميكروويف القياسية لإنتاج 20 مل من 1.5٪ (ث / ت) هلام. صب جل ذاب في طبق بتري 10 سم. وضع شكل حقن مخدد في الاغاروز دافئ حتى أنه بمجرد صلابة، فإن الاغاروز يكون الأخاديد التي سيتم وضعها اليرقة مخدرا 11 (2D و 2E أرقام). </li></ol> 4. حقن (الشكل 3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير اليرقات في 100 مل من الماء الحوض مع 20 ملغ / لتر تريكين (L-إيثيل-M-الأمينية بنزوات الميثان سلفونات) حتى يتوقف عن الاستجابة للمس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام البلاستيك باستور pipettه لنقل بعناية اليرقة مخدرا في أخدود من العفن الرطب الاغاروز بحيث الجانب البطني تواجه ضد الجدار الاغاروز العمودي للأخدود (الشكل 3A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة الاغاروز تحت stereomicroscope بحيث البطين تواجه بعيدا عن إبرة الحقن (الشكل 3A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض الإبرة إلى أدخله في البطين في القلب. ادخال الإبرة فقط 1-2 ميكرون إلى البطين مع الحرص على عدم ادخال الإبرة عميقا جدا (أرقام 3B و 3C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم إدخال الإبرة، وضخ الحل morpholino إلى البطين مع 4-6 والبقول، وتقديم كل NL 3 من الحل، مع انتظار فترات السماح المقاصة من القلب (أرقام 3D و 3E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحقن، وإزالة الإبرة (موازية لطائرة من الإدراج) ومن ثم نقل بعناية اليرقة باستخدام ماصة باستور بلاستيكية مملوءة E3 المتوسطة البكالورياك في طبق بتري تحتوي المتوسطة E3 الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع إبرة في طبق بتري تحتوي على برنامج تلفزيوني 1X لمنع جفاف الإبرة عند نقل اليرقة حقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 4،1-4،6 كل 12-24 ساعة لمدة التجربة. ملاحظة: تكرار الحقن يضمن امتصاص وصيانة morpholino في الخلايا. </li></ol> 5. تحليلات حقن (الشكل 4) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الأسماك في 100 مل من الماء الحوض مع 20 ملغ / لتر تريكين حتى يتوقف عن الاستجابة للمس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع اليرقة أفقيا على شقة الرطب 1.5٪ (ث / ت) لوحة الاغاروز مغطاة E3 المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليرقات الصورة باستخدام stereomicroscope مع brightfield والتصوير مضان. ملاحظة: كما أن اليرقات شفافة، ينبغي أن يكون morpholino فلوريسئين الموسومة مرئية كما الفلورية الخضراء في الأوعية الدموية في جميع أنحاء الحيوان مباشرة بعد الحقن. وهذا مضان مزيد من تفريق إلى الأنسجة عن طريق أوعية دموية15 دقيقة (أرقام 4A-4C). </li></ol> 6. تقييم التجديدي ثمرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم الصور الملتقطة باستخدام فيجي صورة J البرمجيات الحرة (http://fiji.sc/Fiji). للتحقيق في التجديد، واستخدام أداة تتبع خط لتحديد مقدار النمو التجديدي الذي طرأ على السيطرة وحقن morpholino اليرقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمعايرة الصور، فتح أحد ملفات الصور الأصلية في فيجي عن طريق سحب وإسقاط الملفات في إطار فيجي الرئيسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتعيين نطاق لجميع الصور التالية، انتقل إلى &quot;تحليل&quot; في القائمة الرئيسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في القائمة المنسدلة انقر على &quot;نطاق محدد&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في هذا الإطار، بدوره على &quot;جلوبل&quot; الخيار بالضغط على خانة الاختيار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن فتح الصورة لقياس مقدار النمو التجدد مرة أخرى عن طريق السحب والإسقاط (انظر الخطوة 6.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار &quot;التحديدات مرفوعة&quot; أداة في شريط الأدوات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطويق المنطقة المراد قياسها (فايgures 4J-4L). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على Ctrl + M. وهذا فتح جديد &quot;نتائج&quot; نافذة تظهر قيمة المنطقة المحاصرة في مربع بكسل. </li></ol>

<ol>
	<li>Gemberlin, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration.">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).</li><li>Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+zebrafish.">Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish.</a> Nature Protocols. 6, 2011 (1998).</li><li>Skromne, I., Prince, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+perspectives+in+zebrafish+reverse+genetics:+moving+forward.">Current perspectives in zebrafish reverse genetics: moving forward.</a> Developmental Dynamics. 237, 861-882 (2008).</li><li>Zu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TALEN-mediated+precise+genome+modification+by+homologous+recombination+in+zebrafish.">TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish.</a> Nature Protocols. 10, 329-332 (2013).</li><li>Bedell, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+using+a+high-efficiency+TALEN+system.">In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system.</a> Nature. 491, 114-118 (2012).</li><li>Kizil, C., IItzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+of+gene+expression+in+the+adult+zebrafish+brain+using+cerebroventricular+microinjection+of+morpholino+oligonucleotides.">Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides.</a> J Vis Exp. , (2013).</li><li>Hyde, D., Godwin, A., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+of+morpholinos+into+the+regenerating+adult+zebrafish+tail+fin.">In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Thummel, R., Bailey, T., Hyde, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+of+morpholinos+into+the+adult+zebrafish+retina.">In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina.</a> J Vis Exp. , (2011).</li><li>Rieger, S., Kulkarni, R. P., Darcy, D., Fraser, S. E., K&#246;ster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dots+are+powerful+multipurose+vital+labeling+agents+in+zebrafish+embryos.">Quantum dots are powerful multipurose vital labeling agents in zebrafish embryos.</a> Developmental Dynamics. 234, 670-681 (2005).</li><li>Madhavan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Pax-6+in+lens+regeneration.">The role of Pax-6 in lens regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. 103, 14848-14853 (2006).</li><li>Gilmour, D. T., Jessen, J. R., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish: a practical approach. 261, 121-143 (2000).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Eisen, J. S., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+morpholino+experiments:+don't+stop+making+antisense.">Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense.</a> Development. 135, 1735-1743 (2008).</li><li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish.">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6, 69-77 (2009).</li><li>Hyatt, T. M., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vectors+and+techniques+for+ectopic+gene+expression+in+zebrafish.">Vectors and techniques for ectopic gene expression in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 59, 117-126 (1999).</li><li>Hans, S., Kaslin, J., Freudenreich, D., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+controlled+site-specific+recombination+in+zebrafish.">Temporally controlled site-specific recombination in zebrafish.</a> PLoS One. 4, (2009).</li><li>Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf+signaling+instructs+position-dependent+growth+rate+during+zebrafish+fin+regeneration.">Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration.</a> Development. 132, 5173-5183 (2005).</li><li>Liu, S., D, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+for+cancer.">Zebrafish models for cancer.</a> Annu. Re. Pathol. Mech. Dis. 6, 71-93 (2011).</li><li>Stoick-Cooper, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Wnt+signaling+pathways+have+opposing+roles+in+appendage+regeneration.">Distinct Wnt signaling pathways have opposing roles in appendage regeneration.</a> Development. 134, 479-489 (2007).</li><li>Shen, S. P., Aleksic, J., Russell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+targets+of+the+Sox+domain+proteins+Dichaete+in+the+Drosophila+CNS+via+targeted+expression+of+dominant+negative+proteins.">Identifying targets of the Sox domain proteins Dichaete in the Drosophila CNS via targeted expression of dominant negative proteins.</a> BMC Dev. Biol. 13, (2013).</li><li>McNeish, J. D., Scott, W. J., Potter Jr, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legless,+a+novel+mutation+found+in+PHT1-1+transgenic+mice.">Legless, a novel mutation found in PHT1-1 transgenic mice.</a> Science. 241, 837-839 (1988).</li><li>Covarrubias, L., Nishida, Y., Terao, M., D'Eustachio, P., Mintz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+DNA+rearrangements+and+early+developmental+arrest+caused+by+DNA+insertion+in+transgenic+mouse+embryos.">Cellular DNA rearrangements and early developmental arrest caused by DNA insertion in transgenic mouse embryos.</a> Mol. Cell. Biol. 7, 2243-2247 (1987).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

يوفر حقن داخل البطيني طريقة تقييم سريع وموثوق بها لاختبار وظيفة الجين في مراحل لاحقة من التطور أو من التوازن الجسم دون التأثير على وظيفة الجين خلال مرحلة التطور الجنيني. لضمان نجاح هذه التقنية، ينبغي للمرء أن يكون على بينة من أربع نقاط هامة: 1) حجم الإبرة، 2) التجفيف من الإبرة، 3) التقليل من حجم، و4) الحد الأدنى من التعرض الوقت في حل التخدير. سوف الإبر التي هي صغيرة جدا تسد كثير من الأحيان، بينما الإبر التي تكون كبيرة جدا سيضر البطين ويسبب النزيف. في حين أن 20 ميكرون من المستحسن، أن الإبرة أبدا أن يكون أكثر من خمس حجم غرفة البطين. وهناك نقطة حرجة الثاني هو الحفاظ على الإبرة من الجفاف وانسداد. صغر حجم الإبرة وتوقف متكررة لا مفر منه لرزين، ونقل موقف اليرقة يمكن أن توفر ما يكفي من الوقت للسماح للmorpholino في طرف الإبرة لتجف وتسد الإبرة. لمنعهذا، يمكن للمرء أن تزج إبرة في طبق بتري من برنامج تلفزيوني 1X. وهناك نقطة حرجة الثالث هو تقليل الانتفاخ من البطين بواسطة عالية جدا من الصوت. إذا كان الدواء محدود بسبب حجم الإبرة، ثم زيادة عدد الحقن الأفضل دائما لزيادة حجم: يمكن أن تسبب إصابات كميات أكبر تمتد إلى القلب. وهناك نقطة حرجة الرابع هو مدى التخدير. وتستند في الوقت تخدير على طول الفترة الزمنية اللازمة لهذا الإجراء. يمكن أن تبقى اليرقات في حل التخدير وتبقى مخدرا لعدة دقائق، لأنها قوية نوعا ما، وإنعاش بدلا بسهولة. ومع ذلك، والحفاظ على الأسماك وقتا طويلا في التخدير سوف يضعف الانتعاش أو قصيرة جدا سوف تسبب لهم لاحياء خلال الحقن. لذلك، ينبغي للمرء أن رزين فقط عدد اليرقة يمكن للمرء أن تضخ في غضون فترة 4 دقائق. واحد الحد من هذا الأسلوب الحالي هو أن morpholino لا يستهدف وظيفة الجين في الأنسجةبطريقة محددة. يمكن تعديلين مختلفة توفر خصوصية الأنسجة: واحد التعديل هو استخدام morpholinos في قفص. بعد التنشيط بواسطة ضوء الليزر من المجهر متحد البؤر، وهذه الجينات morpholinos تمنع الهدف، ويمكن التعرض متحد البؤر توقيت ذلك توفير التحكم الزماني والمكاني للنشاط morpholino. وقد استخدمت morpholinos قفص لاستهداف الجينات خلال التنمية في وقت مبكر بعد الحقن في الجنين خلية واحدة. بينما التسليم في مرحلة وحيدة الخلية يمكن أن تعمل لاستهداف جينات خلال مرحلة التطور الجنيني، فإن تركيز morpholino المرجح أن تكون منخفضة جدا في مراحل اليرقات في وقت لاحق نظرا لعدد من الانقسامات الخلوية المتتالية كما تقدم التنمية إلى مرحلة اليرقات 13. كمية morpholino يمكن للمرء أن تضخ في مرحلة خلية واحدة يقتصر أيضا سمية 13-15. والتعديل الثاني هو ممكن لحقن morpholino مباشرة في الجهاز أو الأنسجة لدراستها عند حجم والتصوير سماح. اليرقة الزرد شفافة، لذلك موس مشاهدةر الأعضاء الداخلية بعد أن تكون قد وضعت لا ينبغي أن يكون مشكلة. وmorpholinos الموسومة فلوريسئين العمل مع هذا البروتوكول؛ وبالتالي، مضان يمكن استخدامها لتتبع توزيع وتوطين الأنسجة محددة من morpholino. إدماج morpholino فلوريسئين الموسومة إلى خلايا الأنسجة يتطلب وجود كاشف إندو بورتر، لذلك التعديل سيكون آخر للحد من التوزيع المكاني للكاشف إندو بورتر عن طريق حقن كميات أقل في ذلك مباشرة في الأنسجة المستهدفة. وبالتالي، يجب أن يكون القرار المكانية ممكن مع هذه التقنية. هناك طرق من overexpression المعدلة وراثيا والتي تنص على مراقبة الزمنية والمكانية للخارجية التعبير الجيني من خلال الجمع بين المروجين الأنسجة محددة مع حرارة صدمة أو المروجين-تاموكسيفين محرض والتي تمكن من تحليل وظيفة الجين في مراحل لاحقة من التطوير أو في أنسجة معينة باستخدام الأنسجة المروجين محددة 16-19. ويشمل هذا transgeالتعبير شركة الاستثمارات الوطنية من ثوابت المهيمنة سلبية تهدف إلى خلق المنتجات التي يمكن أن تكومبيتي الجين الذاتية. هذه الاستراتيجية ضربة قاضية هو عرضة للتأثيرات خارج الهدف عندما تنتج التحوير مستويات التعبير غير المتناسب للمنتج المعدلة وراثيا التي تستحوذ على مكاسب من وظيفة الآثار 20 أو عندما تندمج الجينات ويعطل وظيفة الجين الذاتية 21، 22. بينما morpholinos يمكن أن يولد أيضا خارج الهدف آثار، يمكن للمرء التحكم أكثر سهولة والحد من هذه الآثار باستخدام morpholinos مراقبة عدم تطابق مع تسلسل الهدف مماثلة ولكن تغير قليلا أن لا ربط مرنا المستهدفة، باستخدام morpholinos العقاقير المتعددة التي تستهدف سلاسل مختلفة داخل نفس مرنا وعن طريق اختبار تركيزات مختلفة morpholino 13-15. علاوة على ذلك، morpholinos يمكن أن تنتج وتختبر أسرع وأرخص من تصميم، ورفع واختبار مختلف خطوط المعدلة وراثيا المهيمنة سلبية. لذلك، فيحقن traventricular من morpholinos يوفر أداة مفيدة لضربة قاضية الجينات في مراحل لاحقة من التطور، عندما نقل الجينات المهيمنة سلبية غير ممكن. عندما الممكن استراتيجية المعدلة وراثيا المهيمنة على السلبية، حقن morpholino داخل البطيني هو نهج بديل لتأكيد خصوصية التحوير المهيمنة سلبية بإفراط (overexpressed). فمن المرجح أن تركيزات فعالة بين morpholinos مختلفة سوف تختلف، كما يفعلون عند استخدامها لضربة قاضية الجين خلال مرحلة التطور الجنيني 13، 15. لهذا الجين المستهدف في هذه الدراسة، ونحن لم نلاحظ تأثير على تجديد بجرعات أقل من 3.5 ملم، ولم تراع آثار غير محددة في عدم تطابق مع هذا يتحكم تركيز morpholino. حقن داخل البطيني يسمح لتوزيع جزيئات صغيرة لتقييم نشاط وفعالية في نظام الحيوان كله في الوقت الحقيقي عندما فعالية محدودة بسبب penetتقنين عن طريق الجلد أو الجهاز الهضمي أو عن طريق مبالغ مجمع المتاحة. كما يسمح استهداف الأنسجة عندما لا يمكن استهداف عن طريق الحقن المباشر، كما هو الحال بالنسبة لfinfold. هذه الطريقة لا توفر ليس فقط أداة لدراسة وظيفة الجين خلال تجديد الزعانف في مراحل اليرقات. منذ morpholino يدمج في finfold اليرقات تضم خلايا اللحمة المتوسطة والبشرة، قد توفر أيضا تقنية مناسبة للتحقيق في دور الجينات التي تلعب دورا في عملية التئام الجروح أو حدوث سرطان الجلد. ويمكن أيضا أن تطبق على حقن morpholino جنبا إلى جنب مع إندو بورتر لاستهداف أعضاء أو أنسجة في الزرد الكبار، والتي هي قابلة للجراحة وخطوط الزرد الكبار شفافة متوفرة. وعلاوة على ذلك، وهذه الطريقة لا يقتصر على الزرد؛ التشتت عن طريق الحقن داخل البطيني يمكن استخدامها على نماذج الفقاريات الأخرى كذلك، وخاصة تلك النماذج التي لا تزال تفتقر إلى وسائل فعالة الجينات المتنحيةمثل الضفدع، قنفذ البحر ونيوت، والتي هي أيضا نماذج هامة للدراسات التجدد. وبالتالي، حقن داخل البطيني في الزرد يوفر القدرة على السيطرة مؤقتا التعبير الجيني مع بروتوكول السريع نسبيا لاستهداف أنسجة متعددة، وبراعة هذا الأسلوب يسمح للاستخدام مع خطوط المعدلة وراثيا الزرد فضلا عن غيرها من الكائنات التي تفتقر نقل الجينات الوظيفية أو استراتيجيات خروج المغلوب الجينات.

تجديد الأجهزة والزوائد المهم بشكل أساسي من أجل البقاء واللياقة البدنية؛ ومع ذلك، العديد من الفقاريات بما في ذلك رجل حدت قدرات التجدد. بينما توجد العديد من النماذج الحيوانية التي لديها القدرة على التجدد واسعة، عكس التقنيات الوراثية لتقييم وظيفة الجين خلال الجهاز وأطرافهم التجديد تبقى محدودة جدا أو غير موجودة. لذا، ثمة حاجة إلى نهج جديد لتشريح البيولوجيا الجزيئية للتجديد في هذه الكائنات الطراز. الزرد هو نموذج راسخة لفهم الخلية والبيولوجيا الجزيئية من الجهاز وأطرافهم تجديد 1، وليس فقط بسبب قدرة كبيرة لتجديد أجهزة متعددة والأنسجة والزوائد، ولكن أيضا لأن العديد من خطوط الأسماك المعدلة وراثيا موجودة لتعقب الخلايا و لoverexpress الجينات يبني 2، 3. ومع ذلك، وتثبيط الجينات في الزرد اليرقات يقتصر أساسا إلى overexpression من بنيات المهيمنة على السلبية، والتي ليست متاحة لجميع الجينات في المصالح أو التي يمكن الحصول على مكاسب من وظيفة الآثار التي لا تعكس النشاط الذاتية من الجين المنتج التحوير. وبالتالي، هناك حاجة إلى طريقة بديلة لإزالة تحديدا التعبير الجيني بالضربة القاضية أو ضربة قاضية للتغلب على هذه القضايا. الجينات المحددة التي تستهدف استخدام TALENS موجود كوسيلة الوراثية العكسية لبالضربة القاضية وظيفة الجين؛ ومع ذلك، فإن هذه الاستراتيجية هو خروج المغلوب محدودة جدا في كثير من الأحيان إلى عمليات تقييم وظيفية خلال مرحلة التطور الجنيني المبكر، لأن الاحتياجات الأولية من الجين منع المزيد من التقدم من التطور الجنيني. وبالتالي، دراسة الظواهر في وقت لاحق مثل تجديد أو توازن الجهاز بعد التطوير باستخدام TALENS تنتفي صفة 4، 5. وبالتالي، هناك حاجة إلى الجين استراتيجية إزالة البديلة التي تستهدف وظيفة الجين بعد التنمية في وقت مبكر لتقييم متطلبات الجينات في الأجهزة والهياكل تشكيلها بالكامل. </ع&gt; وقد تبين Morpholino الحقن لتكون فعالة في استهداف الجينات في عدد قليل من أجهزة الكبار والكبار تجديد زعنفة 6-8، ولكن هذه الأساليب تتطلب التثقيب الكهربائي والعديد من الأعضاء الداخلية يصعب ل electroporate إما بسبب موقعها أو بسبب حساسيتها للالكهربائية انقطاع. علاوة على ذلك، بعض الأنسجة في يرقة يصعب حقن مباشر، وذلك لأن الحقن المباشر قد يعطل السلامة الهيكلية أو بسبب حجمها يحد. الزعنفة الذيلية لليرقة واحدة من هذه البنية، لأن الحقن المباشر في finfold غير ممكن. وبالتالي، هناك حاجة إلى بديل لالتثقيب الكهربائي والحقن المباشر لاستهداف الجينات في الأنسجة التي إما أن تكون صغيرة جدا لحقن أو لا يمكن electroporated. من أجل استهداف وتمنع وظيفة جينات معينة خلال تجديد الزعنفة الذيلية اليرقات، ونحن قد عدلت التقنيات morpholino القائمة السماح لssessment من خلال تجديد وظيفة الجين الزعنفة الذيلية في وقت متأخر من مراحل اليرقة. هذا الأسلوب يعمل داخل البطيني تسليم 9 من بين فلوريسئين الموسومة morpholinos جنبا إلى جنب مع إندو بورتر ترنسفكأيشن الكاشف 10. مرة واحدة في البطين، خليط morpholino-إندو بورتر ينتشر بسرعة في جميع انحاء اليرقة عن طريق الأوعية الدموية ويدخل الأنسجة التي كان من المستحيل سابقا لاستهداف. هذه الطريقة حقن يجوز تعديل لاستهداف الجينات في أنسجة معينة وربما الى حد بعيد يمكن تطبيقها في النماذج الحيوانية الأخرى التي تفتقر حاليا أساليب الوراثية العكسية لتثبيط وظيفة الجينات. وبالتالي، فإنه يوفر طريقة سريعة وسهلة مع إمكانية استخدام مجموعة واسعة لدراسة وظيفة الجين على الفور خلال توازن الجهاز عامة والتجديد في مراحل اليرقات.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:672px;" width="673">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:171px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Reagent/Material</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Morpholino with 3&#180;fluorescein tag</td>
			<td style="width:171px;">Gene Tools Inc.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Customized</td>
			<td style="width:167px;">More information on www.genetools.com</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Endo-Porter</td>
			<td style="width:171px;">Gene Tools Inc.&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">More information on www.genetools.com</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:171px;">Serva</td>
			<td style="width:119px;">120623</td>
			<td style="width:167px;">For pouring plates to place the fish during injections and imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tricane (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate)</td>
			<td style="width:171px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">E3 medium (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl2; 0.33 mM MgSo4)</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">For larval husbandry</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Petri Dishes</td>
			<td style="width:171px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">821.472</td>
			<td style="width:167px;">For placing the fish during injections and imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;Equipment</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Thin Wall Glass Capillaries</td>
			<td style="width:171px;">World Precision Instruments, Inc.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">TW100F-3</td>
			<td style="width:167px;">For preparing injection needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microloader pipette tips</td>
			<td style="width:171px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5,242,956,003</td>
			<td style="width:167px;">For loading the needle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pasteur Pipettes (3 ml/1 ml)</td>
			<td style="width:171px;">Brand</td>
			<td style="width:119px;">747760/ 74775</td>
			<td style="width:167px;">For transfering larva</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Flaming / Brown&#160; needle puller&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Sutter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">More information on www.sutter.com</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Watchmaker (Dumont) Tweezers (size 5)</td>
			<td style="width:171px;">World Precision Instruments, Inc.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">501985</td>
			<td style="width:167px;">To brake the needle before sharpening</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dissecting microscope</td>
			<td style="width:171px;">Olympus, Leica, Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">Varies with the manufacturer</td>
			<td style="width:167px;">Part of the whole injection setup</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fluorescence camera</td>
			<td style="width:171px;">Olympus, Leica, Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">Varies with the manufacturer</td>
			<td style="width:167px;">To image the fluorescence after injeciton</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PicoNozzle kit (microinjector holder)</td>
			<td style="width:171px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">5430-12</td>
			<td style="width:167px;">For microinjections</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pneumatic PicoPump (microinjector)</td>
			<td style="width:171px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">SYS-PV820</td>
			<td style="width:167px;">For microinjections</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reverse genetic morpholino approach using cardiac ventricular injection to transfect multiple difficult-to-target tissues in the zebrafish larva

الزرد هو نموذج مهم لفهم الخلية والبيولوجيا الجزيئية من الجهاز وأطرافهم التجدد. ومع ذلك، استراتيجيات لتوظيف الجزيئية وعلم الوراثة العكسية لم يتم تطويرها بشكل كاف لتقييم وظيفة الجين في تجديد أو توازن الأنسجة أثناء مراحل اليرقات بعد مرحلة التطور الجنيني الزرد، والعديد من الأنسجة داخل اليرقة الزرد يصعب استهدافها. الحقن داخل البطينات من morpholinos الجينات المحددة تقدم طريقة بديلة لعدم القدرة الحالية لاستهداف genomically الجينات الزرد في الطريقة التي تسيطر عليها مؤقتا في هذه المراحل. يسمح هذا الأسلوب لتشتت كاملة والتأسيس لاحقة من morpholino في الأنسجة المختلفة في جميع أنحاء الجسم، بما في ذلك الهياكل التي كانت في السابق من المستحيل التوصل إلى مثل تلك الموجودة في الزعنفة الذيلية اليرقات، بنية غالبا ما تستخدم للبحث noninvasively تجديد الأنسجة. وحاضرا أيضا العديد من الجينات تفعيلها خلال اليرقات finfold التجديدر في تجديد الأنسجة الفقاريات الكبار، وبالتالي فإن اليرقة هو نموذجا مفيدا لفهم التجديد في البالغين. يسمح هذا الأسلوب morpholino التشتت لتحديد سريعة وسهلة من الجينات المطلوبة لتجديد أنسجة اليرقات وكذلك الظواهر الفسيولوجية الأخرى التي تنظم توازن الأنسجة بعد مرحلة التطور الجنيني. لذلك، يوفر هذا الأسلوب تسليم استراتيجية حاجة حاليا للسيطرة الزمني لتقييم وظيفة الجين بعد مرحلة التطور الجنيني.

يتم وضع حاد، مشطوف حقن الإبرة بسهولة في البطين في القلب من اليرقة الزرد عندما اقترب ظهريا (الشكل 3A). قلب يستمر الضخ ويتم الاحتفاظ تدفق الدم رغم وجود إبرة (أرقام 3B و 3C). الحقن الدقيق لا يعطل التشكل من البطين أو تقلصات القلب (الشكل 3D) على الرغم من حقن morpholino في قلب (الشكل 3E). في غضون دقائق، والحل morpholino-إندو بورتر توزع في جميع أنحاء الجسم عبر الأوعية الدموية (أرقام 4A و 4B). ثم يتم توزيع morpholino من الأوعية الدموية إلى الأنسجة المختلفة مثل finfold والدماغ لا يقل عن 12 ساعة أو أكثر كما لوحظ من مضان (الشكل 4C). في هذا النهج، ونحن إزالة الطرف البعيد من اله finfold، الطرف البعيد من الحبل الشوكي والعضلات الجذع البعيدة، والحبل الظهري القاصي والخلايا الصبغية (أرقام 4D و4H)؛ وكلها صعبة خصيصا لاستهداف عن طريق الحقن المباشر بسبب الاكتناز (العضلات)، صغيرة الحجم (النخاع الشوكي والحبل الظهري) وركاكة (finfold)، ولكن يبدو أن دمج morpholino بعد الحقن البطيني المسلسل، والتي ينظر إليها من قبل مضان داخل هذه الأنسجة (الشكل 4E) بالمقارنة مع الحيوانات uninjected (أرقام 4F و 4G). وبالتالي، فإن هذا الأسلوب يعزز بسهولة نسبيا تسليم morpholino إلى الأنسجة التي يصعب تستهدف بشكل فردي، وأنه يسمح تقييم وظيفة الجينات في العديد من الأنسجة في زعنفة تجديد مرة واحدة. لتقييم أهمية جينات معينة تشارك في التجديد، واحد يبتر جراحيا جزئيا الزعنفة الذيلية اليرقات (الشكل 4H)، resecting جميع الأنسجة التي لديها incorp<html> orated في morpholino (الشكل 4I). وfinfold اليرقات تجدد بنيتها في غضون بضعة أيام آخر بتر (د ب أ) (الشكل 4J). استهداف Morpholino &#160; الجينات المطلوبة للتجديد (بيانات غير منشورة) يؤدي إلى استجابة التجدد قلق (الشكل 4K) مقارنة uninjected (الشكل 4J) والضوابط morpholino عدم تطابق (الشكل 4L). الأثر الكلي لهذه التجارب morpholino على ثمرة التجدد يمكن قياسها باستخدام أدوات كيمونسيجيا القياسية في برامج فيجي المتاحة للعموم 12 عن طريق تتبع الأنسجة المجددة وبمقارنة المناطق (أرقام 4J-4L). وبالتالي، يوفر هذا الأسلوب استهداف الجينات مقايسة سريعة وسهلة نسبيا لاختبار أهمية الجينات في عملية التجديد. <html> 5fig1highres.jpg &quot;العرض =&quot; 500 &quot;/&gt; الشكل 1. إعداد الإبر الزجاج الشعرية للحقن. A) زجاج أنبوب شعري قبل سحب (أعلاه) وسحبت إبرة (أدناه). ب) إبرة جهاز سحب. C) مخرطة لالميلا وشحذ الإبرة الزجاج. وينظر الإبرة من خلال مناظير. D) ومخرطة هو المبللة القرص الغزل المطاط. وخفضت الإبرة ببطء على القرص. يجب أن يكون E) شحذ إبرة شطبة القصيرة التي لم يعد (20 ميكرون) مما هو واسعة (20 ميكرون) لتقليل المساحة اللازمة لإدراج نهاية كاملة من الإبرة في القلب اليرقات البطين. F) العالي تكبير الصورة تظهر غيض من الإبرة. G) عرض تخطيطي من طرف الإبرة التي تبين شكل شطبة بعد شحذ. s/ftp_upload/51595/51595fig2highres.jpg &quot;العرض =&quot; 500 &quot;/&gt; تعيين الرقم 2. جهاز حقن ما يصل ألف) جهاز كامل لحقن morpholino في اليرقة الزرد. B) الاحتياطية للسيطرة على موضع إبرة أثناء الحقن. C) مضخة بيكو الذي ينظم الضغط الهوائية للحقن. D) نموذج الصحافة استخدامها لإنشاء قالب الاغاروز. E) العفن الاغاروز تستخدم لتحقيق الاستقرار يرقة للحقن. <img alt="الرقم 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51595/51595fig3highres.jpg" width="400" /> الرقم 3. حقن يرقة السمك. A) موضع إبرة فيما يتعلق اليرقة الزرد. B) الإدراج في البطين في القلب. C) الإسفار من morpholino في الإبرة ولكن غائبة في البطين قبل injectiعلى. D) Brightfield صورة يوضح العلاقة بين حجم الإبرة الزجاج والبطين اليرقات. E) من حقن morpholino فلوري إلى البطين في القلب. قضبان مقياس يساوي 100 ميكرون. <img alt="الرقم 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51595/51595fig4highres.jpg" width="500" /> الشكل 4. تشتت morpholino في جميع أنحاء الأسماك. A) الزرد لمدة 3 أيام اليرقة القديمة. ب) الإسفار من morpholino في جميع أنحاء الجسم الأوعية الدموية (الخامس) 5 دقائق آخر البطين الحقن. C) التشتت من morpholino في جميع أنحاء الحيوانية بما في ذلك finfold (وو) الموسومة فلوريسئين والدماغ (ب) في كبار السن اليرقة بعد حقن كل 12 ساعة morpholino D) مناديل في الزعنفة الذيلية اليرقات والجذع:. الحبل الظهري (ن) والحبل الشوكي (الشوري)، الصباغ (ع)، وfinfold (و و) E) تفرقوا morpholinoبعد عدة دقائق الحقن في أنسجة اليرقات الجذع بما في ذلك finfold. F) صورة Brightfield من الجذع اليرقات uninjected والزعنفة الذيلية. خط متقطع يدل على طائرة بتر المحتملين. G) زعنفة Uninjected المصورة مع مرشح GFP تظهر تألق ذاتي باللون الأخضر (السهام). شكل شجيري من الهياكل الاستشعاع يشير إلى أن هذه هي الخلايا الصبغية. H) Brightfield صورة الزعنفة الذيلية اليرقات بتر جراحيا من خلال الحبل الظهري، والعضلات والنخاع الشوكي. الأول) صورة نيون تظهر توزيع morpholino في الأنسجة جدعة. Morpholino إدماجها في العضلات، والحبل الشوكي، الحبل الظهري وfinfold. J) مجدد الهياكل finfold الذيلية البرية من نوع اليرقة. خط أسود يتتبع الأنسجة المجددة للتحليل الكمي. K) تثبيط Morpholino بوساطة من التجدد. تتبع الخط الأسود يبرز بوضوح انخفاض تجديد إعادةبعد استجابته morpholino ضربة قاضية. L) مجدد finfold الذيلية من يرقة حقن مع morpholino السيطرة عدم تطابق تظهر استجابة مماثلة كما هو الحال في تجديد يرقة uninjected (J). قضبان مقياس يساوي 100 ميكرون.

Watch this Scientific Journal Video about Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva at JoVE.com

Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva

طريقة الوراثية العكسية للتكيف الزرد لتقييم وظيفة الجين خلال مراحل لاحقة من التطور والتوازن الفسيولوجية مثل تجديد الأنسجة باستخدام الحقن داخل البطينات من morpholinos الجينات المحددة.

عكس النهج الوراثية عن طريق القلب البطيني Morpholino حقن لبالنقل متعددة يصعب الهدف الأنسجة في الزرد اليرقة

The zebrafish is an important model to understand the cell and molecular biology of organ and appendage regeneration. However, molecular strategies to ...

reverse-genetic-morpholino-approach-using-cardiac-ventricular

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.5K Views.  Technische Universität Dresden.  طريقة الوراثية العكسية للتكيف الزرد لتقييم وظيفة الجين خلال مراحل لاحقة من التطور والتوازن الفسيولوجية مثل تجديد الأنسجة باستخدام الحقن داخل البطينات من morpholinos الجينات المحددة. 

Video: Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinjection من مرنا والعقاقير [أليغنوكليوتيد] Morpholino اسماك الزرد في الأجنة.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Zebrafish Brain Ventricle Injection

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved cavities within the brain that are filled with cerebrospinal fluid.  In zebrafish, after neural tube formation, the neuroepithelium undergoes a series of constrictions and folds while it fills with fluid resulting in brain ventricle formation.  In order to understand the process of ventricle formation, and the neuroepithelial shape changes that occur at the same time, we needed a way to visualize the ventricle space in comparison to the brain tissue.  However, the nature of transparent zebrafish embryos makes it difficult to differentiate the tissue from the ventricle space.  Therefore, we developed a brain ventricle injection technique where the ventricle space is filled with a fluorescent dye and imaged by brightfield and fluorescent microscopy.  The brightfield and the fluorescent images are then processed and superimposed in Photoshop.  This technique allows for visualization of the ventricle space with the fluorescent dye, in comparison to the shape of the neuroepithelium in the brightfield image.  Brain ventricle injection in zebrafish can be employed from 18 hours post fertilization through early larval stages.  We have used this technique extensively in our studies of brain ventricle formation and morphogenesis as well as in characterizing brain morphogenesis mutants (1-3).

After neural tube formation, the neuroepithelium constricts and folds while the tube fills with embryonic cerebrospinal fluid (eCSF) to form the embryonic brain ventricles. We developed this ventricle injection technique to better visualize the fluid filled space in contrast to the neuroepithelial shape in a live embryo.

الزرد حقن الدماغ البطين

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is often the most effective and noninvasive form of delivery of an agent of interest. In the zebrafish (Danio rerio), IV injection of drugs has long been a challenge because of the small vessel diameter. This has also proved a significant hurdle for the injection of cells during hematopoeitic stem cell transplantation. Historically, injections into the bloodstream were done directly through the heart. However, this intra-cardiac procedure has a very high mortality rate as the heart is often punctured during injection leaving the fish prone to infection, massive blood loss or fatal organ damage. Drawing on our experience with the mouse, we have developed a new injection procedure in the zebrafish in which the injection site is behind the eye and into the retro-orbital venous sinus. This retro-orbital (RO) injection technique has been successfully employed in both the injection of drugs in the adult fish as well as transplantation of whole kidney marrow cells. RO injection has a much lower mortality rate than traditional intra-cardiac injection. Fish that are injected retro-orbitally tend to bleed less following injection and are at a much lower risk of injury to a major organ like the heart. Further, when performed properly, injected cells and/or drugs quickly enter the bloodstream allowing compounds to exert their effect on the whole fish and kidney cells to easily home to their niche. Thus, this new injection technique minimizes mortality while allowing efficient delivery of material into the bloodstream of adult fish. Here we exemplify this technique by retro-orbital injection of Tg(globin:GFP) cells into adult casper fish as well as injection of a red fluorescent dye (dextran, Texas Red ) into adult casper fish. We then visualize successful injections by whole animal fluorescence microscopy.

Here we show how to do retro-orbital injection in adult zebrafish.

الرجعية المدارية في حقن اسماك الزرد الكبار

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

باستخدام الجينات Electroporation MXcell بولسير النظام لTransfect الخلايا الأولية ذات الكفاءة العالية

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing and adult tissue. An advance in this concept is Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM), linking gene expression, cell fate, and cell behaviors in vivo, to create fate maps based on genetic lineage.
GIFM exploits X-CreER lines where X is a gene or set of gene regulatory elements that confers spatial expression of a modified bacteriophage protein, Cre recombinase (CreERT). CreERT contains a modified estrogen receptor ligand binding domain which renders CreERT sequestered in the cytoplasm in the absence of the drug tamoxifen. The binding of tamoxifen releases CreERT, which translocates to the nucleus and mediates recombination between DNA sequences flanked by loxP sites. In GIFM, recombination typically occurs between a loxP flanked Stop cassette preceding a reporter gene such as GFP.
Mice are bred to contain either a region- or cell type-specific CreER and a conditional reporter allele. Untreated mice will not have marking because the Stop cassette in the reporter prevents further transcription of the reporter gene. We administer tamoxifen by oral gavage to timed-pregnant females, which provides temporal control of CreERT release and subsequent translocation to the nucleus removing the Stop cassette from the reporter. Following recombination, the reporter allele is constitutively and heritably expressed. This series of events marks cells such that their genetic history is indelibly recorded. The recombined reporter thus serves as a high fidelity genetic lineage tracer that, once on, is uncoupled from the gene expression initially used to drive CreERT.
We apply GIFM in mouse to study normal development and ascertain the contribution of genetic lineages to adult cell types and tissues. We also use GIFM to follow cells on mutant genetic backgrounds to better understand complex phenotypes that mimic salient features of human genetic disorders.
This video article guides researchers through experimental methods to successfully apply GIFM. We demonstrate the method using our well characterized Wnt1-CreERT;mGFP mice by administering tamoxifen at embryonic day (E)8.5 via oral gavage followed by dissection at E12.5 and analysis by epifluorescence stereomicroscopy. We also demonstrate how to micro-dissect fate mapped domains for explant preparation or FACS analysis and dissect adult fate-mapped brains for whole mount fluorescent imaging. Collectively, these procedures allow researchers to address critical questions in developmental biology and disease models.

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM) marks and tracks cells with fine spatial and temporal control in vivo and elucidates how cells from a specific genetic lineage contribute to developing and adult tissues. Demonstrated here are the techniques required to fate map E12.5 mouse embryos for epifluorescent and explant analysis.

نهج عملي لرسم الخرائط الوراثية محرض مصير : دليل مرئي لمارك وتعقب خلايا في فيفو</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

نهج عكس الوراثية لاختبار التكرار وظيفية خلال مرحلة التطور الجنيني

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

حقن داخل الصفاق الى اسماك الزرد الكبار

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavaging اسماك الزرد الكبار

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

سم كلوي حقن مكروي في الزرد لنموذج قصور كلوي حاد

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen

Studies on skeletal muscle physiology face the technical challenge of appropriately processing the specimens to obtain sections with clearly visible cytoplasmic compartments. Another hurdle is the tight apposition of myofibers to the surrounding tissues. Because the process of tissue fixation and paraffin embedding leads to the shrinkage of muscle fibers, freezing is an optimal means of hardening muscle tissue for sectioning. However, a commonly encountered issue, the formation of ice crystals, occurs during the preparation of frozen sections because of the high water content of muscle. The protocol presented here first describes a simple and efficient method for properly freezing muscle tissues by immersing them in liquid nitrogen. The problem with using liquid nitrogen alone is that it causes the formation of a nitrogen gas barrier next to the tissue, which acts as an insulator and inhibits the cooling of the tissues. To avoid this "vapor blanket" effect, a new cryovial was designed to increase the speed of liquid flow around the tissue surface. This was achieved by punching a total of 14 inlet holes in the wall of the vial. According to bubble dynamics, a higher rate of liquid flow results in smaller bubbles and fewer chances to form a gas barrier. When liquid nitrogen flows into the cryovial through the inlet holes, the flow velocity around the tissue is fast enough to eliminate the gas barrier. Compared to the method of freezing muscle tissues using pre-chilled isopentane, this protocol is simpler and more efficient and can be used to freeze muscle in a throughput manner. Furthermore, this method is optimal for institutions that do not have access to isopentane, which is extremely flammable at room temperature.

This protocol describes a procedure to freeze muscle tissues by plunging them directly into liquid nitrogen. This protocol also highlights a new cryovial that can avoid the &#34;blanket effect&#34; of nitrogen gas when liquid nitrogen contacts the tissue surface of a specimen.

A متعدد حفرة Cryovial يزيل تجميد قطع أثرية عندما منغمسين الأنسجة العضلية مباشرة في النيتروجين السائل

Studies on skeletal muscle physiology face the technical challenge of appropriately processing the specimens to obtain sections with clearly visible ...