والمؤلفان بالشكر ليندا تيرنر للمساعدة في إعداد الميكروبيولوجية. وتم تمويل RZ وLGW من قبل معهد رولاند في جامعة هارفارد وCGB كما تم تمويل مؤسسة عالم الرؤوس، والعلوم بلا حدود البرنامج، البرازيل (عملية # 7340-11-7)

1. الإعداد والحصول على البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو ثقافة العقدية سلالة V4051-197 (السباحة على نحو سلس) الخلايا في كتاي المتوسطة من الأسهم المجمدة 22. احتضان في شاكر دوارة بين عشية وضحاها في 35 درجة مئوية و 150 دورة في الدقيقة، لالتشبع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم 10 مل من الطازجة المتوسطة كتاي مع 500 ميكرولتر من ثقافة مشبعة. احتضان لمدة 3.5 ساعة أخرى في 35 درجة مئوية و 150 دورة في الدقيقة حتى الخلايا التوصل إلى الكثافة البصرية ما يقرب من 1.0 في λ = 600 نانومتر (حوالي 5 × 10 8 خلية / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع 1:400 في وسائل الإعلام الجديدة للحصول على التركيز النهائي للخلايا متحركة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على شريحة المجهر، وجعل حلقة من الشحوم (على سبيل المثال من حقنة مليئة الفازلين) حوالي 1 مم في الارتفاع ووضع قطرة من محلول العينة في المركز. وضع غطاء زجاجي على أعلى واضغط برفق على حواف لختم، وضمان أن السائل هو في اتصال مع كل الشرائح والزجاج غطاء. وينبغي أن تكون حجرة العينة الناتجة أروالثانية 100-200 ميكرون في العمق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع حجرة العينة في المجهر مع غطاء زجاجي لأسفل، وبعناية، لمنع تشكيل فقاعات الهواء في النفط بين الزجاج والعدسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركيز المجهر على السطح السفلي من الغرفة العينة، وتحقيق المكثف على التركيز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيقاف تشغيل الإضاءة القياسية ووضع الرأس الصمام وراء فتحة المكثف من المجهر. تعيين وادى امدادات الطاقة إلى أقصى الانتاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق الفتحة مكثف إلى أقصى مداه، وإذا لزم الأمر، دفع الصمام في جبل لحين تركزت الإضاءة على فتحة عدسة الهدف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل على جهاز الكمبيوتر والكاميرا، وتوجيه كل الضوء إلى منفذ الكاميرا المجهر. ضبط معدل الإطار وحجم الصورة في البرنامج الحصول على الصور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل زمن التعرض الإطار قصيرة قدر الإمكان في حين لا يزال الإبقاء على النقيض جيدة. تحقق صورة كثافة الرسم البياني للتأكد من أن الصورة ليست saturaتيد أو تحت المكشوفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لزم الأمر، إعادة تركيز المجهر بحيث يتم امتبائر موضع اهتمام قليلا (عادة بنسبة 10-30 ميكرون). يجب أن يكون الهدف والمستوى البؤري في نفس المتوسطة (أي البؤري يجب أن تقع داخل حجرة العينة). </li></ol> 2. إعادة الإعمار الخطوة الأولى في معالجة البيانات لإعادة تركيز عدديا إطار الفيديو في سلسلة من أعماق مختلفة، وإنتاج كومة من الصور. صديقة للمستخدم البرنامج للقيام بذلك ويمكن الاطلاع هنا: <a href="http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html">http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html</a> جنبا إلى جنب مع صور سبيل المثال (المكتسبة باستخدام مجهر مقلوب، و60X الغمر النفط عدسة الهدف) وملف المسرح لتتبع أشعة التقديم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدخال إطار المصالح والخلفية الخاصة به على شكل ملفات صورة منفصلة، ​​في المربعات ذات الصلة على الواجهة. صورة الخلفية هو الإطار الذي وairly يمثل خلفية شريط الفيديو، في غياب صورة ثلاثية الأبعاد، وسيتم استخدامها لقمع أي الضوضاء نمط ثابت التي يمكن أن تتداخل مع التعريب صورة ثلاثية الأبعاد وتحليلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدخال قيم في مربعات الإعدادات العمومية على الجانب الأيسر من الشاشة قبل تشغيل البرنامج. الثلاثة الأولى هي إخراج معلمات مكدس: الموقف المحوري من الإطار الأول (&#39;بدء التركيز&#39;)؛ عدد من الشرائح في كومة بناؤها (&#39;عدد من الخطوات&#39;)؛ مسافة محورية بين كل شريحة في المكدس (&#39;حجم الخطوة&#39;) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل إعادة بناء الأجسام مع النسب الصحيح، يجب أن يكون حجم الخطوة بنفس حجم التباعد بكسل الجانبي. دخول الجانبية تردد أخذ العينات الكاميرا (تباعد 1/pixel) في المربع &quot;بكسل / ميكرون&quot;، والطول الموجي الإضاءة ومعامل الانكسار المتوسطة في مربعات الماضيين. القيم الافتراضية للبرنامج هي مناسبة لإعادة بناء البيانات المثال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على زر &#39;Z-التدرج فليب&#39; إذا كان مركز objeط مظلمة في صورة ثلاثية الأبعاد (انظر الإطار سبيل المثال لعام 2005 ومناقشة القسم لمزيد من التفاصيل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق من ممر الموجة مرشح على / قبالة الدولة (الافتراضي هو جرا). هذا ممر الموجة مرشح اختياري، وتقع في المربع أدناه التبديل التدرج في الوجه، هي المسؤولة عن قمع مساهمة من بكسل صاخبة. يتم تطبيق ممر الموجة مرشح لكل شريحة الصورة على الفور بعد جيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق من التبديل الناتج متوسطة على / قبالة الدول (الافتراضي هو جرا). تتم كتابة الخطوات تحليل وسيطة في اثنين من أشرطة الفيديو الناتج، غير مضغوط ملفات افي: الأول هو مكدس تركيز (اسم الملف تنتهي في &#39;_stack.avi&#39;)، والثاني هو مكدس بعد العملية التدرج المحوري (اسم الملف تنتهي في &#39; _gradient.avi &#39;). من الناحية المثالية، سوف يحتوي هذا المكدس الثاني موضع اهتمام أبرز ككائن مشرق على خلفية داكنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد وضع جميع المعلمات، اضغط على &quot;تشغيل&quot; في النافذة الرئيسية. سيظهر الإطار المحدد في المربع الرئيسي من البرنامج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدامالمكبرة أداة الزجاج وجدت في شريط الأدوات على يسار الصورة للتكبير (فوق اليسار) والتصغير (التحول + فوق اليسار). استخدام الأداة مستطيل على شريط الأدوات لتحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI). التقاط أكبر عدد ممكن من هامش الهولوغرام وممكن داخل المستطيل، حيث سيؤدي ذلك إلى تحسين إعادة الإعمار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على زر &#39;عملية&#39; لتوليد اثنين من مداخن الصورة. تفقد المداخن الناتجة باستخدام يماغيج (التي يمكن الحصول عليها مجانا في <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ). إذا كان موضع اهتمام ويمكن رؤيتها بوضوح في صورة التدرج مكدس، انتقل إلى الخطوة التالية لاستخراج الإحداثيات الكائن. </li></ol> 3. أداء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى جانب إعادة تركيز الإطار، يمكن هذا البرنامج تحديد إحداثيات س، ص، ض لكل فوكسل في كائن من الفائدة. اضغط على زر &#39;ميزة استخراج &quot;لتمكين هذه الوظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدخال مسار، بما في ذلك التمديد (على سبيل المثال: C: منزل output.inc)، لخرج إحداثيات ملف. اختر &#39;نمط بوف راي &quot;في مربع&quot; تنسيق الإخراج أسلوب&#39;. يؤدي هذا البرنامج إلى إرسال ملف الكائن الذي يمكن تصور باستخدام بوف راي حزمة البرامج raytracing الحرة (التي يمكن الحصول عليها من <a href="http://www.povray.org/">http://www.povray.org/</a> ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعادة معالجة الصور كما في القسم 2 أعلاه. سيوفر البرنامج سلسلة من (س، ص، ض) الإحداثيات في العائد على الاستثمار مختارة، وكتب إلى اسم الملف في &#39;إخراج التنسيق&#39; مربع. استخراج الإحداثيات الكائن يأخذ فترة أطول كثيرا من الجيل المكدس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن العينة ملف بوف راي (مرفق مع رمز إعادة الإعمار) هو في نفس المجلد مثل ملف الإحداثيات ولدت للتو. تحرير ملف بوف العينة. واستبدال اسم الملف في الفواصل المقلوب على الخط # تشمل &quot;MYFILE.inc&quot; مع اسم ملف البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة رمز إعادة الإعمار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر فوق الزر &#39;تشغيل&#39; في بوف راي لتقديم صورة نقطية. Tانه موقف الكاميرا، والإضاءة وخيارات الملمس ليست سوى عدد قليل من التخصيصات ممكن في بوف راي؛ راجع وثائق على الانترنت لمزيد من التفاصيل. </li></ol>

<ol>
	<li>Xu, W., Jericho, M. H., Meinertzhagen, I. A., Kreuzer, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+in-line+holography+for+biological+applications.">Digital in-line holography for biological applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (20), 11301-11305 (2001).</li><li>Sheng, J., Malkiel, E., Katz, J., Adolf, J., Belas, R., Place, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+holographic+microscopy+reveals+prey-induced+changes+in+swimming+behavior+of+predatory+dinoflagellates.">Digital holographic microscopy reveals prey-induced changes in swimming behavior of predatory dinoflagellates.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 17512-17517 (2007).</li><li>Lee, S. H., Roichman, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+tracking+single+colloidal+particles+with+video+holographic+microscopy.">Characterizing and tracking single colloidal particles with video holographic microscopy.</a> Opt. Express. 15 (26), 18275-18282 (2007).</li><li>Fung, J., Martin, K. E., Perry, R. W., Katz, D. M., McGorty, R., Manoharan, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+translational,+rotational,+and+vibrational+dynamics+in+colloids+with+digital+holographic+microscopy.">Measuring translational, rotational, and vibrational dynamics in colloids with digital holographic microscopy.</a> Opt. Express. 19 (9), 8051-8065 (2011).</li><li>Lee, S. H., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holographic+microscopy+of+holographically+trapped+three-dimensional+structures.">Holographic microscopy of holographically trapped three-dimensional structures.</a> Opt. Express. 15 (4), 1505-1512 (2007).</li><li>Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+techniques+of+digital+holographic+microscopy.">Principles and techniques of digital holographic microscopy.</a> SPIE Rev. 1, 018005 (2010).</li><li>Corkidi, G., Taboada, B., Wood, C. D., Guerrero, A., Darszon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+sperm+in+three-dimensions.">Tracking sperm in three-dimensions.</a> Biochem. Biophys. Res. Comm. 373, 125-129 (2008).</li><li>Santi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy+:+A+Review.">Light Sheet Fluorescence Microscopy : A Review.</a> J. Histochem. Cytochem. 59, 129-138 (2011).</li><li>van Blaaderen, A., Wiltzius, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Real-Space Structure of Colloidal Hard-Sphere Glasses. Science. 270, 1177-1179 (1990).</li><li>Besseling, R., Weeks, E. R., Schofield, A. B., Poon, W. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Imaging+of+Colloidal+Glasses+under+Steady+Shear.">Three-Dimensional Imaging of Colloidal Glasses under Steady Shear.</a> Phys. Rev. Lett. 99, 028301 (2007).</li><li>Schall, P., Weitz, D., Spaepen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Rearrangements+That+Govern+Flow+in+Colloidal+Glasses.">Structural Rearrangements That Govern Flow in Colloidal Glasses.</a> Science. 318, 1895-1899 (2007).</li><li>Rosen, J., Brooker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+incoherent+color+holography.">Fluorescence incoherent color holography.</a> Opt. Exp. 15, 2244-2250 (2007).</li><li>Jericho, M. H., Kreuzer, H. J., Kanka, M., Riesenberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+phase+and+refractive+index+measurements+with+point-source+digital+in-line+holographic+microscopy.">Quantitative phase and refractive index measurements with point-source digital in-line holographic microscopy.</a> Appl. Opt. 51 (10), 1503-1515 (2012).</li><li>Mudanyali, O., Erlinger, A., Seo, S., Su, T., Ozcan, D. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lensless+On-chip+Imaging+of+Cells+Provides+a+New+Tool+for+High-throughput+Cell-Biology+and+Medical.">Lensless On-chip Imaging of Cells Provides a New Tool for High-throughput Cell-Biology and Medical.</a> J. Vis. Exp. 34, (2009).</li><li>Langehanenberg, P., Kemper, B., Dirksen, D., von Bally, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofocusing+in+digital+holographic+phase+contrast+microscopy+on+pure+phase+objects+for+live+cell+imaging.">Autofocusing in digital holographic phase contrast microscopy on pure phase objects for live cell imaging.</a> Appl. Opt. 47 (19), (2008).</li><li>Elliot, M. S., Poon, W. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+optical+microscopy+of+colloidal+suspensions.">Conventional optical microscopy of colloidal suspensions.</a> Adv. Coll. Interf. Sci. 92, 133-194 (2001).</li><li>Agero, U., Monken, C. H., Ropert, C., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+fluctuations+studied+with+defocusing+microscopy.">Cell surface fluctuations studied with defocusing microscopy.</a> Phys. Rev. E. 67, 051904 (2003).</li><li>Born, M., Wolf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Optics, 6th Ed. , (1998).</li><li>Wilson, L., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Localization+of+weak+scatterers+in+digital+holographic+microscopy+using+Rayleigh-Sommerfeld+back-propagation.">3D Localization of weak scatterers in digital holographic microscopy using Rayleigh-Sommerfeld back-propagation.</a> Opt. Express. 20, 16735-16744 (2012).</li><li>Bohren, C., Huffman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Absorption and Scattering of Light by Small Particles. , (1983).</li><li>Balaev, A. E., Dvoretski, K. N., Doubrovski, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractive+index+of+escherichia+coli+cells.">Refractive index of escherichia coli cells.</a> Saratov Fall Meeting 2001: Optical Technologies in Biophysics and Medicine III. 4707 (1), 253-260 (2002).</li><li>Berg, H. C., Manson, M. D., Conley, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+Energetics+of+Flagellar+Rotation+in+Bacteria.">Dynamics and Energetics of Flagellar Rotation in Bacteria.</a> Symp. Soc. Exp. Biol. 35, 1-31 (1982).</li><li>Garcia-Sucerquia, J., Xu, W., Jericho, S. K., Klages, P., Jericho, M. H., Kreuzer, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+in-line+holographic+microscopy.">Digital in-line holographic microscopy.</a> Appl. Optics. 45 (5), 836-850 (2006).</li><li>Restrepo, J. F., Garcia-Sucerquia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnified+reconstruction+of+digitally+recorded+holograms+by+Fresnel-Bluestein+transform.">Magnified reconstruction of digitally recorded holograms by Fresnel-Bluestein transform.</a> Appl. Optics. 49 (33), 6430-6435 (2010).</li><li>Dubois, F., Joannes, L., Legros, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+three-dimensional+imaging+with+a+digital+holography+microscope+with+a+source+of+partial+spatial+coherence.">Improved three-dimensional imaging with a digital holography microscope with a source of partial spatial coherence.</a> Appl. Optics. 38 (34), 7085-7094 (1999).</li><li>Kanka, M., Riesenberg, R., Petruck, P., Graulig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+(NA=0.8)+in+lensless+in-line+holographic+microscopy+with+glass+sample+carriers.">High resolution (NA=0.8) in lensless in-line holographic microscopy with glass sample carriers.</a> Opt. Lett. 36 (18), 3651-3653 (2011).</li><li>Dubois, F., Requena, M. L., Minetti, C., Monnom, O., Istasse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+spatial+coherence+effects+in+digital+holographic+microscopy+with+a+laser+source.">Partial spatial coherence effects in digital holographic microscopy with a laser source.</a> Appl. Optics. 43 (5), 1131-1139 (2004).</li><li>Magariyama, Y., Sugiyama, S., Muramoto, K., Kawagishi, I., Imae, Y., Kudo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+bacterial+flagellar+rotation+rate+and+swimming+speed.">Simultaneous measurement of bacterial flagellar rotation rate and swimming speed.</a> Biophysical Journal. 69 (5), 2154-2162 (1995).</li><li>Berg, H. C., Brown, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+in+Escherichia+coli+analysed+by+three-dimensional+tracking.">Chemotaxis in Escherichia coli analysed by three-dimensional tracking.</a> Nature. 239 (5374), 500-504 (1972).</li><li>Brooker, G., Siegel, N., Wang, V., Rosen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+resolution+in+Fresnel+incoherent+correlation+holographic+fluorescence+microscopy.">Optimal resolution in Fresnel incoherent correlation holographic fluorescence microscopy.</a> Opt. Express. 19 (6), 5047-5062 (2011).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

أهم خطوة في هذا البروتوكول التجريبي هو التقاط دقيقة من الصور من الإعداد التجريبية مستقرة. مع البيانات الأساسية الفقراء والتعمير الدقة العالية هو أقرب إلى المستحيل. من المهم أيضا لتجنب العدسات الهدف مع عنصر النقيض من المرحلة الداخلية (مرئية كما بالطوق الظلام عندما تبحث عن طريق الجزء الخلفي من الهدف)، وهذا يمكن أن تتحلل الصورة أعيد بناؤها. وينبغي أن يكون موضع اهتمام بعيدا بما فيه الكفاية من المستوى البؤري أن بضعة أزواج من هامش حيود واضحة في صورتها (أ ارشادي مناسبة هو أن نمط امتبائر يجب أن تظهر لديك 10 مرات البعد الخطي للكائن مركزة - راجع بيانات المثال ). الأشياء القريبة جدا من المستوى البؤري يعانون من التوأم الصورة وأخذ العينات القطع الأثرية، كما هو موضح سابقا. من المهم أيضا أن يكون هناك توصيف جيد للتباعد الكاميرا بكسل، وهذا يشكل عاملا حاسما في تحديد مسافات إعادة التركيز بشكل صحيح. في كثير من الأحيان، وكاميرا documentatأيون سوف قائمة &#39;حجم بكسل&#39; في المواصفات، وهذا يمكن أن يكون غامضا قليلا، لأنواع معينة من الكاميرا (الكاميرات CMOS على وجه الخصوص) يمكن أن يكون لها مساحات كبيرة من الفضاء بين بكسل التي ليست حساسة للضوء. الطريقة الأكثر موثوقية للحصول على هذه المعلومات هي استخدام هدف المعايرة القياسية، مثل القوات الجوية الأمريكية 1951 قرار المخطط، وقياس تردد أخذ العينات (عدد بكسل لكل ميكرومتر) مباشرة من الصورة. والحد من الإضاءة أحادي اللون، تم تعيين دقة نظام DIHM نهاية المطاف من قبل الفتحة العددية للعدسة الهدف (NA) والطول الموجي من (λ) إضاءة 23،24. نقطة تفصل أفقيا يجب أن تقع على الأقل مسافة Δ اللات = &#39;λ&#39; / 2NA بصرف النظر إذا ما أريد لها أن تحل بشكل منفصل. وبالمثل، يتم إعطاء قرار الحد المحوري في حالة مثالية ل &#39;Δ&#39; الفأس = λ / 2 (NA) 2. عند استخدام LED في DIHM، هناك حد لعمقوحدة التخزين التي يمكن تصويرها، وهذا يتحدد في نهاية المطاف من قبل النظام البصري وتماسك الإضاءة. وعمق نموذجية من هذا &#39;حجم حساسة &quot;حوالي 100-200 ميكرون لLED، على الرغم من وصفا تفصيليا لهذا النوع من التأثير يمكن العثور في أي مكان آخر 25. هو حجم الحساسة محدودة في الأخريين الاتجاهات حسب حجم من الصورة. على الرغم من أن البرنامج هو قوية إلى حد ما، بعض العمليات هي بالأحرى الذاكرة الجياع. إعادة بناء مكدس الصورة والحصول على التدرج كثافة على حد سواء المحافظ إلى حد ما، ولكن يمكن استخراج إحداثيات سمة من سمات الفائدة من كومة التدرج تستهلك الكثير من الذاكرة (عدة مئات ميغابايت إلى عدة غيغابايت). تحقيقا لهذه الغاية، فإنه من المستحسن لتقييد حجم أعيد بناؤها من تهم 100-150 بكسل في كل البعد. يمكن تخفيف هذا القيد نوعا ما إذا تم تشغيل التعليمات البرمجية على نظام تشغيل 64 بت مع أكثر من 4 غيغابايت من ذاكرة الوصول العشوائي (وقد كتب البرنامج على الجهاز مع 12 غيغابايت)،على الرغم من أن الوقت اللازم للحساب يمكن أن تصبح باهظة. لدراسة نظام أكبر، ومصدر للضوء LED ويمكن الاستعاضة عن الليزر، والذي يسمح إعادة بناء الأجسام الكذب على عمق أكبر بكثير من المستوى البؤري - بسهولة ما يصل إلى ملليمتر - وعلى أقل التكبير. التجارب الأولية مع مثل هذا الإعداد، وذلك باستخدام ليزر ديود إلى جانب الألياف البصرية أحادية النمط، يسمح بناؤها أعماق تصل إلى 10 ملم باستخدام الهدف 10X المجهر. هذا العمق زيادة الحقل يأتي بتكلفة، ولكن؛ كبيرة طول التماسك الليزر يؤدي إلى تشويش الصورة، وخاصة الانعكاسات من السطوح المختلفة في القطار البصرية ويقابل هذه الآثار إلى حد ما (على جدران حجرة العينة، السطوح عدسة، الخ.) عندما الجهاز مستقرة بما فيه الكفاية للحصول على صورة خلفية جيدة. ومع ذلك، وانعكاسات غريبة لها التوزيع غير معروف من مراحل، لذلك إذا حجمها هي مماثلة لتلك الموجة المرجعية (ضوء unscattered)، التعميريمكن أن تصبح كشن المستحيل. الكتاب الآخرين قد عدلت تماسك مصدر ضوء الليزر، على سبيل المثال، من خلال تحوير الليزر القيادة الحالية 26 أو باستخدام الدورية شاشة زجاجية الأرض للحد من التماسك 27. من وجهة نظر استكشاف الأخطاء وإصلاحها نظر، واجه معظم المشاكل أثناء استخدام برنامج إعادة الإعمار الثلاثية الأبعاد هي أفضل حل عن طريق التفتيش المراحل الانتقالية من تحليل البيانات. في حالة الصورة أعيد بناؤها المكدس، الكائنات يجب &#39;deblur&#39; بشكل متناظر لأنها تأتي في التركيز. إذا كان هامش حيود تبدو غير المتكافئة بقوة، صورة خلفية فقيرة أو تعويض في كثير من الأحيان إلى إلقاء اللوم. إذا كان قد تم التقاط الصورة لاعادة الاعمار من كومة من صور مماثلة، على سبيل المثال إطارا من سلسلة فيديو لجسم متحرك، ويمكن في بعض الأحيان الحصول على صورة خلفية عن طريق حساب متوسط ​​(عن طريق متوسط ​​أو متوسط) القيم بكسل عبر كل من الفيديو الإطارات. إذا تحرك هذا الموضوع بشكل كبير خلال تسلسل الفيديو، لمساهمة إلى أي قيمة بكسل واحد صغير وسوف تأتي مساهمة المهيمنة من إطارات الخلفية دون تغيير في أي موضوع كان غائبا. وفي حالة ما إذا لم يتم إرجاع الإحداثيات الكائن بشكل صحيح، يمكن التدرج صورة مكدس تكون مفيدة التشخيص. إذا تم النظر إلى الكائن كما فراغا تحيط بها حلقة مشرقة في صورة التدرج المكدس، وينبغي انقلبت مرشح التدرج والصورة إعادة تصنيعها. كما ذكر في المقدمة، وطريقة إعادة الإعمار رايلي-سمرفلد غير حساس لعلامة مسافة كائن من البؤري. إذا كائنين نثر ضعيفة هي نفس المسافة من البؤري ولكن على طرفي نقيض، فإنها تأتي في التركيز في نفس الموقف في الصورة أعيد بناؤها المكدس. ومع ذلك، سيكون عكس أنماطها كثافة المحوري. مركز الكائن وجدت أصلا فوق المستوى البؤري (فيما يتعلق الهندسة مجهر مقلوب) يتغير من الضوء إلى الظلام على مرورا بو في التركيزsition، في حين أن جسم أدناه التغييرات البؤري من الظلام الى النور. وبالتالي فإن الخيار التدرج الوجه مقتطفات إما كائنات فوق المستوى البؤري (الافتراضي) أو أقل من المستوى البؤري (مع التدرج الوجه لمجموعة &#39;على&#39;)، وهو ما يعطي محوري لا لبس فيها التنسيق. لاحظ أن هذا يحمل بدقة فقط لكائنات نثر ضعيفة؛ الأسلوب يعمل بشكل جيد جدا لالمجهرية البوليسترين تصل إلى 1 ميكرومتر في القطر، ولكن بشكل أقل لجزيئات البوليستيرين أكبر. العينات البيولوجية تظهر عادة نثر أضعف بكثير، ومؤشراتها الانكسار هي أقرب إلى الوسط المحيط (البوليسترين لديها معامل الانكسار على مقربة من 1.5)، الأجسام الكبيرة حتى يمكن دراستها. من حيث التوجهات المستقبلية، ويمكن تمديد هذا البرنامج لمعالجة إطارات متعددة في الفيديو، لتمكين تتبع الكائنات الدقيقة السباحة أو الجسيمات الغروية في ثلاثة أبعاد. معدل الإطار العالية التي تتيح هذه التقنية هي مناسبة تماما لتتبع حتى أسرع السباحةالسائدة، مثل الضمة alginolyticus التي تعيش في المحيطات، والتي تسبح بسرعات تصل إلى 150 ميكرون / ثانية 28. وتتبع مسارات السباحة مجهرية من الخلايا واحد لأول مرة منذ بعض الوقت 29، ولكن هذا عادة ما يتطلب أجهزة متخصصة. المرحلة GOUY الاقتراب الشذوذ ليس فقط يفسح المجال لتتبع بسيط واحد من الخلايا عبر مسافات طويلة، ولكن يتيح الفرصة لدراسة العلاقات المتبادلة بين سلوك السباحة من مختلف الأفراد. هذا يعتمد تحديدا على الهندسة ثلاثية الأبعاد، والبيانات التي كانت حتى الآن لا يمكن الوصول إليها لأسباب فنية. كما ذكر في المقدمة، مقارنة مع مضان المجهري متحد البؤر ليست مثالية، ولكن انتشار ونظم متحد البؤر يجعل المقارنة من الجانب التصوير ثلاثي الأبعاد جديرة بالاهتمام. في الواقع، DIHM مكمل للالمجهري متحد البؤر، وهناك مزايا وعيوب كل من المقارنة. DIHM يسمح أسرع بكثير acquisitio البياناتمعدلات ن: عدة آلاف من وحدات التخزين في الثانية الواحدة أمر روتيني، نظرا الكاميرا بسرعة كافية. وهذا يسمح تتبع (على سبيل المثال) البكتيريا السباحة متعددة، الذي هو أبعد من قدرة نظم متحد البؤر أبطأ. حتى مع وجود الكاميرا بسرعة، DIHM هو أمر من حجم أرخص من المجهري متحد البؤر، ويمكن تخزين البيانات لحجم ثلاثي الأبعاد في صورة ثنائية الأبعاد واحد، والحد من الطلب على تخزين البيانات والنسخ الاحتياطي. DIHM هو أكثر استيعابا بسهولة بمعنى أن العمل مع تكبير السفلى، عينات أكبر ومسافات أطول العمل هو تافهة. المجهري متحد البؤر لا تزال لديه اليد العليا في عينات كثيفة أو معقدة، ولكن. على سبيل المثال، في تعليق الغروية الكثيفة، نثر متعددة يجعل من المستحيل عمليا إعادة الإعمار الثلاثية الأبعاد؛ فإن نظام متحد البؤر إما في الانبعاثات الفلورسنت أو وضع انعكاس تكون أكثر ملاءمة لدراسة مثل هذه النظم 9. علاوة على ذلك، متحد البؤر المجهري هو خيار أكثر طبيعية لأنظمة التجريبية التي ووضع العلامات luorescent له أهمية مركزية. على الرغم من ثبت مضان تصوير ثلاثي الأبعاد للعمل مع مجموعة من اختبار يخضع 30 كفاءة جمع هو حاليا أقل بكثير من أن نظام متحد البؤر جيدة. علاوة على ذلك، مثل هذه النظم التجريبية تتطلب حاليا أجهزة البصرية المتخصصة والخبرة في العمل؛ نأمل أنها سوف تصبح متاحة على نطاق أوسع مع مزيد من التطوير. باختصار، DIHM لا نظير له في قدرته على الحصول على صور عالية الدقة ثلاثية الابعاد من الكائنات المجهرية، بسرعات عالية. نحن نقدم البرمجيات سهلة الاستخدام التي تجعل من هذه التقنية في متناول nonspecialist مع تعديلات الحد الأدنى لمجهر القائمة. وعلاوة على ذلك، فإن البرنامج إعادة الإعمار يتكامل بسهولة مع برنامج العرض متاحة بحرية الكمبيوتر. وهذا يسمح التصور بديهية من الموضوعات المجهرية، للعرض من أي زاوية. نظرا لطبيعة ثلاثية الأبعاد من العديد من العمليات المجهرية سريع يضم هذاكائنات نثر ضعيفة جي (مثل الضرب سياط حقيقية النواة أو أهداب، والسباحة البكتيريا، أو نشرها الغرويات)، وينبغي أن تكون هذه التقنية من الفائدة عبر مجموعة واسعة من المجالات.

مضمنة الرقمية المجهر الثلاثية الأبعاد (DIHM) يسمح بسرعة التصوير ثلاثي الأبعاد للعينات مجهرية، مثل الكائنات الحية الدقيقة السباحة 1،2 و 3،4 أنظمة المسألة لينة، مع الحد الأدنى من التعديل لإعداد المجهر القياسية. في هذه الورقة يتم توفير مظاهرة تربوية من DIHM، تتمحور حول برنامج تم تطويره في المختبر. وتشمل هذه الورقة وصفا لكيفية إعداد المجهر، وتحسين الحصول على البيانات، ومعالجة الصور المسجلة لإعادة بناء البيانات ثلاثية الأبعاد. برنامج (مقرها في جزء منه على البرامج التي وضعتها المديرية العامة جرير وغيرهم 5) والمثال الصور هي متاحة بحرية على موقعنا. ويرد وصف الخطوات اللازمة لتكوين المجهر، وإعادة بناء ثلاثة مجلدات الأبعاد من الصور المجسمة وتقديم وحدات التخزين الناتجة من الاهتمام باستخدام شعاع الحرة تتبع حزمة البرامج. تخلص الورقة مع مناقشة العوامل التي تؤثر على جودة إعادة الإعمار، ومقارنة مع طرق DIHM المتنافسة. على الرغم من DIHM وصفت منذ بعض الوقت (لاستعراض عام للمبادئ وتطورها، انظر كيم 6)، والقدرة الحاسوبية المطلوبة وصورة الخبرة تجهيز وحتى الآن تقتصر إلى حد كبير استخدامه لمجموعات بحثية متخصصة مع التركيز على تطوير الصك. هذا الوضع يتغير في ضوء التطورات الحديثة في مجال الحوسبة والتكنولوجيا الكاميرا. يمكن لأجهزة الكمبيوتر المكتبية الحديثة التعامل بسهولة مع تجهيز ومتطلبات تخزين البيانات؛ CCD أو CMOS الكاميرات موجودة في معظم مختبرات الفحص المجهري، وتبذل البرنامج المطلوبة متاحة بحرية على شبكة الانترنت من قبل الجماعات الذين استثمروا الوقت في تطوير هذه التقنية. وقد اقترحت عدة مخططات لتصوير تكوين الكائنات المجهرية في حجم العينة ثلاثية الأبعاد. العديد من هذه التقنيات يتم مسح 7،8، والتي يتم تسجيلها في كومة من الصور عن طريق مترجمة echanically الطائرة الصورة من خلال العينة. المسح المجهري متحد البؤر مضان وربما كان المثال الأكثر دراية. عادة، يتم إضافة صبغة الفلورسنت إلى كائن المرحلة من أجل تحقيق مستوى مقبول من عينة النقيض من ذلك، وترتيب متحد البؤر تستخدم لتوطين مكانيا الانبعاثات الفلورسنت. وقد أدى هذا الأسلوب إلى تقدم كبير، على سبيل المثال في العلوم الغروي، حيث سمح لها الوصول إلى ديناميكية ثلاثية الأبعاد للأنظمة مزدحمة 9-11. استخدام الوسم هو الفرق المهم بين المجهري متحد البؤر مضان وDIHM، ولكن ميزات أخرى من التقنيات اثنين تستحق المقارنة. DIHM لديه ميزة سرعة كبيرة في هذا الجهاز ليس لها أجزاء متحركة. المرايا المسح الميكانيكية في أنظمة متحد البؤر وضع حد أعلى لمعدل الحصول على البيانات - عادة حوالي 30 لقطة / ثانية للحصول على صورة بكسل 512 X 512. وتستخدم مجموعة من مثل هذه الصور من طائرات التنسيق المختلفة التي يمكن أن يحصل عليها جسديا translating المرحلة عينة أو عدسة الهدف بين الإطارات، مما أدى إلى معدل التقاط النهائية حول حجم واحد في الثانية لمدة 30 إطار المكدس. في المقابل، يمكن لنظام الثلاثية الأبعاد استنادا على كاميرا CMOS الحديثة التقاط 2،000 لقطة / ثانية في نفس حجم الصورة والقرار؛ تتم معالجة كل إطار `حاليا &#39;لإعطاء لقطة مستقلة من حجم العينة. أن أكرر: ليس مطلوبا من عينات الفلورسنت لDIHM، على الرغم من أن النظام تم تطويره الذي ينفذ إعادة الإعمار الثلاثية الأبعاد للموضوع الفلورسنت 12. فضلا عن معلومات وحدة التخزين ثلاثي الأبعاد، DIHM يمكن أن تستخدم أيضا لتوفير الكمية المرحلة على النقيض من الصور 13، ولكن هذا خارج نطاق المناقشة هنا. الصور DIHM البيانات الخام هي ثنائية الأبعاد، وفي بعض النواحي تبدو وكأنها صور المجهر القياسية، وإن كان خارج التركيز. والفرق الرئيسي بين DIHM ومعيار المجهر حقل مشرق يكمن في حلقات حيود التي تحيط الأجسام طن مجال الرؤية، وهذه هي نتيجة لطبيعة الإضاءة. يتطلب DIHM مصدر أكثر تماسكا من حقل مشرق - عادة ما يكون LED أو ليزر. حلقات حيود في صورة ثلاثية الأبعاد تحتوي على المعلومات الضرورية لإعادة بناء صورة ثلاثية الأبعاد. هناك نوعان من الأساليب الرئيسية لتفسير البيانات DIHM؛ المباشر المناسب وإعادة تركيز العددية. النهج الأول هو المعمول بها في الحالات التي يعرف الشكل الرياضي للنمط حيود مقدما 3،4؛ يتحقق هذا الشرط من قبل حفنة صغيرة من أشياء بسيطة مثل المجالات، واسطوانات، والعقبات نصف الطائرة. تركيب المباشرة ينطبق أيضا في الحالات التي يعرف الموقف المحوري للكائن، والصورة يمكن تركيبها باستخدام ننظر إلى أعلى الجدول من القوالب صورة 14. النهج الثاني (إعادة تركيز العددية) بل هي أعم وتعتمد على استخدام حلقات حيود في صورة ثلاثية الأبعاد ثنائي الأبعاد لإعادة بناء المجال البصري عدديا فيعدد من طائرات التنسيق (متباعدة بشكل تعسفي) في جميع أنحاء حجم العينة. توجد العديد من الطرق ذات الصلة للقيام بذلك 6؛ يستخدم هذا العمل رايلي-سمرفلد الظهر تقنية إكثار كما وصفها لي وجرير 5. نتائج هذا الإجراء هو كومة من الصور التي تحاكي تأثير تغيير البؤري المجهر (ومن هنا جاء اسم `إعادة تركيز العددية &#39;) يدويا. مرة واحدة تم إنشاؤها كومة من الصور، يجب الحصول على موقف من هذا الموضوع في الحجم البؤري. ، وقد تم عرض عدد من الاستدلال تحليل الصور، مثل التباين كثافة المحلية أو محتوى التردد المكاني لتحديد من حدة التركيز في نقاط مختلفة في العينة 15. في كل حالة، عندما يتم تكبير الصورة متري معين (أو التقليل منها)، ويعتبر الكائن ليكون في التركيز. خلافا لغيرها من البرامج التي تسعى إلى تحديد المستوى البؤري خاص حيث هو كائن &quot;في التركيز&quot;، وطريقة في هذا العمل يختار من عoints التي تقع داخل الكائن من الفائدة، والتي قد تمتد عبر مجموعة واسعة من طائرات التنسيق. هذا النهج ينطبق على طائفة واسعة من المواضيع ومناسبة خاصة للمدد، وعينات من نثر ضعيفة (كائنات المرحلة)، مثل الغرويات على شكل قضيب، وسلاسل من البكتيريا أو سياط حقيقية النواة. في مثل هذه العينات يغير الصورة النقيض عندما يمر جسم من خلال البؤري؛ صورة امتبائر بها مركز الضوء إذا كان الكائن على جانب واحد من الطائرة ومركز التنسيق الظلام إذا كان من جهة أخرى. كائنات مرحلة نقية ليس لديهم أي النقيض عندما تقع بالضبط في المستوى البؤري. وقد تمت مناقشة هذه الظاهرة من انعكاس على النقيض من قبل مؤلفين آخرين 16،17 هو في نهاية المطاف وبسبب المرحلة GOUY الشذوذ 18. وقد تم وضع هذا على أساس أكثر صرامة في سياق تصوير ثلاثي الأبعاد في أي مكان آخر، حيث يتم تقييم حدود التقنية، وعدم اليقين في موقف نموذجي هو من أجل من 150 نانومتر (ما يقرب من واحد بكسل) في مجموعة شرق افريقياح 19 اتجاه. على طريقة GOUY مرحلة الشذوذ هو واحد من عدد قليل من مخططات DIHM واضحة المعالم لتحديد بنية الكائنات الموسعة في ثلاثة أبعاد، ولكن مع ذلك بعض الكائنات هي إشكالية لإعادة بناء. الكائنات التي تقع مباشرة على طول المحور البصري (مشيرا في الكاميرا) يصعب إعادة بناء بدقة؛ الشكوك في طول وموضع الكائن تصبح كبيرة. هذا القيد هو في جزء منه نتيجة لعمق بت محدود من وحدات البكسل تسجيل الهولوغرام (عدد مستويات الرمادي المتميزة التي يمكن أن تسجل الكاميرا). يحدث التكوين إشكالية أخرى عند موضع اهتمام هو قريب جدا من المستوى البؤري. في هذه الحالة، يتم بناؤها الصور الحقيقية والافتراضية للكائن على مقربة، مما أدى إلى الحقول البصرية المعقدة التي يصعب تفسيرها. ثانيا، والقلق قليلا أقل أهمية هنا هو أن هامش حيود الناتجة تشغل أقل من صورة الاستشعار، وهذا الوقود النووي المشع الحبيبات الخشنةormation يؤدي إلى إعادة بناء ذات جودة الفقيرة. في الممارسة العملية، يتم تطبيق مرشح التدرج إلى وحدات تخزين بسيطة أعيد بناؤها ثلاثي الأبعاد للكشف عن ظاهرة الانقلاب كثافة قوية على طول اتجاه الإضاءة. المناطق التي يتغير بسرعة شدة من الضوء إلى الظلام، أو العكس، ثم يتم المرتبطة المناطق نثر. موصوفة جيدا الأجسام نثر ضعيفة، كمجموعة noninteracting من هذه العناصر 20، وهذه المساهمات الفردية المبلغ لإعطاء مجموع الحقل متناثرة الذي هو مقلوب بسهولة باستخدام رايلي-سمرفلد أسلوب ظهر الانتشار. في هذه الورقة، يتم تطبيق كثافة المحوري تقنية الانحدار إلى سلسلة من الخلايا العقدية. أجسام الخلايا هي كائنات المرحلة (الأنواع كولاي ديها معامل الانكسار قياس 21 ليكون 1.384 في الطول الموجي λ = 589 نانومتر؛ من المرجح أن تكون مماثلة سلالة العقدية) وتبدو وكأنها سلسلة عالية الكثافة من النقط المتصلة في اله حجم العينة بعد التصفية التدرج تم تطبيقه. عتبة وميزة أساليب الاستخراج القياسية المطبقة على وحدة التخزين هذه تصفيتها تسمح استخراج بكسل الحجمي (voxels) المقابلة لمنطقة داخل الخلايا. وهناك ميزة خاصة لهذا الأسلوب هو أنه يتيح إعادة الإعمار لا لبس فيه من موقف كائن في الاتجاه المحوري. أساليب مماثلة (على الأقل، وتلك التي الهولوغرام سجل على مقربة من وجوه، من خلال تصويرها الهدف المجهر) يعانون من عدم القدرة على تحديد علامة على هذا النزوح. على الرغم من أن طريقة إعادة الإعمار رايلي-سمرفلد هو أيضا التوقيع مستقلة في هذا المعنى، فإن عملية التدرج يتيح لنا أن تميز بين الكائنات المرحلة ضعيفة فوق وتحت المستوى البؤري.

<table><tbody><tr><td>Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope</td><td>Nikon Corp.</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LED</td><td>Thorlabs</td><td>M660L3</td><td>emission wavelength &amp;lambda;=660 nm, linewidth approximately 20 nm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LED power supply</td><td>Thorlabs</td><td>LEDD1B</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Thread Adapter</td><td>Thorlabs</td><td>SM2T2</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Thread Adapter</td><td>Thorlabs</td><td>SM1A2</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Frame Grabber board</td><td>EPIX</td><td>PIXCI E4</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>High-Speed CMOS camera</td><td>Mikrotron</td><td>MC-1362</td><td>&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

digital inline holographic microscopy (dihm) of weakly-scattering subjects

كائنات نثر ضعيفة، مثل الجسيمات الغروية الصغيرة ومعظم الخلايا البيولوجية، كثيرا ما واجه في المجهر. في الواقع، تم تطوير مجموعة من التقنيات لتصور أفضل هذه الكائنات المرحلة؛ الطوري ومدينة دبي للإنترنت هي من بين الأساليب الأكثر شعبية لتعزيز التباين. ومع ذلك، وتسجيل موقف والشكل في الاتجاه خارج التصوير الطائرة لا تزال صعبة. يقدم هذا التقرير المنهج التجريبي بسيطة لتحديد دقيق لمكان وهندسة الكائنات في ثلاثة أبعاد، وذلك باستخدام المجهر مضمنة الرقمية الثلاثية الأبعاد (DIHM). بشكل عام، يتم تعريف حجم العينة الوصول إليها عن طريق حجم مستشعر الكاميرا في الاتجاه الجانبي، وتماسك الإضاءة في الاتجاه المحوري. وتتراوح أحجام عينة نموذجية من 200 ميكرون × 200 ميكرون × 200 ميكرون باستخدام الإضاءة LED، ل5 مم × 5 مم × 5 مم أو أكبر باستخدام إضاءة الليزر. يتم تكوين هذا الضوء الإضاءة بحيث موجات الطائرة هي الحادثة على العينة. الكائنات في حجم العينة ثم تبعثر الضوء، والتي تتعارض مع ضوء unscattered لتشكيل أنماط التدخل عمودي على اتجاه الإضاءة. هذه الصورة (الهولوغرام) يحتوي على المعلومات المطلوبة لإعادة الإعمار عمق ثلاثي الأبعاد، ويمكن أن يتم القبض على جهاز التصوير القياسية مثل CMOS أو كاميرا CCD. يعمل على رايلي-سمرفلد طريقة الانتشار مرة أخرى إلى إعادة تركيز عدديا الصور المجهر، والكشف عن مجريات الأمور التصوير البسيط القائم على المرحلة GOUY الشذوذ يستخدم لتحديد نثر الكائنات ضمن حجم أعيد بناؤها. النتائج هذه الطريقة بسيطة ولكنها قوية في لا لبس فيها، خالية من نموذج قياس موقع وشكل الأشياء في عينات مجهرية.

للتدليل على قدرات DIHM، أجريت التجارب على سلسلة من البكتيريا العقدية. سلسلة نفسها قياس 10.5 مم طويل، وكان يتألف من 6-7 خلايا اسطوانية الكروية (اثنين من الخلايا في سلسلة هي قريبة من تقسيم) بأقطار في نطاق 0،6-1 ميكرون. أرقام 1A 1B وتظهر الواجهة الرئيسية إعادة الإعمار وبرنامج التقديم. وينظر إلى أمثلة من هذا الإجراء إعادة تركيز العددية في الشكل 2، حيث تم تطبيق ممر الموجة مرشح المكانية. الشكل 3 يظهر تأثير مرشح التدرج على الصور في الشكل 2. هي واحدة من البيانات الخام المستخدمة في بناء كل من هذه الصور مع تحميل الكود كما المثال الإطار 108. أخيرا، ويبين الشكل 4 تأثير بيانات جيدة ورديئة الجودة على هندسة أعيد بناؤها. واتخذت كل من الإطارات في هذا الرقم الأخير من شريط فيديو من وسامسلسلة (ه) من الخلايا (سلسلة مختلفة إلى واحد في الأرقام الأولين). وإعادة البناء الجيد هو ممكن في معظم الحالات، ولكن عندما يتم توجيه سلسلة النهاية على إعادة إعمار فشل، وإعطاء كائن جولة كبيرة في المستوى البؤري. هذا الوضع الفشل هو سمة من الكائنات الموجهة على طول المحور البصري. على نطاق و، في الصور المقدمة كمبيوتر، يتحقق على الأرض هي 1 ميكرون على الجانب. للاطلاع على مناقشة أكثر تفصيلا من الدقة ودقة هذه الطريقة، يجب استشارة القراء ويلسون وتشانغ 19. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50488/50488fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50488/50488fig1.jpg" width="500px" /> الشكل 1. واجهات البرمجيات. يظهر الواجهة الرئيسية للبرنامج إعادة الإعمار في لوحة (أ)، حيث صندوق الإدخال الملف، المعلمات الإعدادات العمومية وميزات أخرى هامةالمشار إليها في النص تم تسليط الضوء عليها. لوحة (ب) يظهر ملف سبيل المثال مشهد لبوف راي، في تحرير المشهد الافتراضي للبرنامج. يجب تعيين اسم الملف بين علامتي اقتباس على خط اشارت الى ملف الإخراج من برنامج إعادة الإعمار. قد يكون من الضروري تغيير موقع الكاميرا واتجاهها (القسم ذات الصلة المشار إليها) من أجل تصور صحيح اعادة الاعمار. راجع وثائق بوف راي على الانترنت لمزيد من التعليمات. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50488/50488fig1highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50488/50488fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50488/50488fig2.jpg" width="500px" /> الشكل 2. أمثلة من الصور تركيز عدديا. لوحات شخصية في المعرض العمود الأيمن تركيز عدديا(س، ص) طائرات في مجموعة متنوعة من المرتفعات داخل حجم أعيد بناؤها (كما هو مبين) يظهر أسفل الصورة اليسرى البيانات ثلاثية الأبعاد الأصلي، وتنقسم من خلال البيانات في الخلفية. يظهر لوحة كبيرة على الناحية اليمنى و(خ، ض) شريحة من خلال نفس المكدس. نقطة انعكاس المقابل على طول محور ض يمكن رؤيتها بوضوح عند حوالي ثلث الطريق من الجزء العلوي من الصورة. الخطوط الحمراء على العرض صورة بشكل اكبر حيث هذه الطائرة (خ، ض) يتقاطع (س، ص) الطائرات إلى اليسار. وبالمثل، فإن الخطوط الزرقاء في لوحات صغيرة تظهر تقاطع (خ، ض) شريحة. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50488/50488fig2highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50488/50488fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50488/50488fig3.jpg" width="500px" /> الرقم 3. أمثلة من الصور التي تمت تصفيتها التدرج.0؛ هذه الصورة تبين أثر تطبيق مرشح التدرج إلى البيانات في الشكل 2. لاحظ أن الكائن من الفائدة يتم تمييز بمثابة نقطة مضيئة متناظرة. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50488/50488fig3highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الرقم 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50488/50488fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50488/50488fig4.jpg" width="500px" /> الشكل 4. أمثلة من البيانات التي تؤدي إلى صور جيدة والفقراء المقدمة. والصورتين في لوحات (أ) و (ج) أخذت من شريط الفيديو نفسه من سلسلة تراجع من الخلايا. البيانات في لوحة (أ) تمثل معظم الإطارات في هذه السلسلة، التي لا يتم توجيه سلسلة مباشرة على طول المحور البصري. شكل وموضع الكائن مستنسخة بأمانة فيتقديم في لوحة (ب). في حالة لوحة (ج)، وسلسلة موجهة للحظات نهاية إلى المستوى البؤري؛ الكائنات في هذا التكوين من الصعب إعادة بناء، وعادة ما تسفر عن &#39;فقاعة&#39; على مقربة من المستوى البؤري، كما رأينا في لوحة (د ). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50488/50488fig4highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects at JoVE.com

Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects

المواقع الثلاثة الأبعاد للأجسام نثر ضعيفة ويمكن تحديدها بشكل فريد باستخدام مضمنة الرقمية المجهر الثلاثية الأبعاد (DIHM)، والذي ينطوي على تعديلات طفيفة على المجهر القياسية. برنامجنا يستخدم ارشادي التصوير بسيطة إلى جانب رايلي-سمرفلد العودة الانتشار لانتاج موقف ثلاثي الأبعاد والهندسة لكائن المرحلة المجهرية.

الرقمية المضمنة المجسم مجهرية (DIHM) من الموضوعات وكلي نثر

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of ...

digital-inline-holographic-microscopy-dihm-weakly-scattering

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) of Weakly-scattering Subjects

12.2K Views.  Harvard University.  المواقع الثلاثة الأبعاد للأجسام نثر ضعيفة ويمكن تحديدها بشكل فريد باستخدام مضمنة الرقمية المجهر الثلاثية الأبعاد (DIHM)، والذي ينطوي على تعديلات طفيفة على المجهر القياسية. برنامجنا يستخدم ارشادي التصوير بسيطة إلى جانب رايلي-سمرفلد العودة ?...

Video: Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects

Lensless Fluorescent Microscopy on a Chip

On-chip lensless imaging in general aims to replace bulky lens-based optical microscopes with simpler and more compact designs, especially for high-throughput screening applications. This emerging technology platform has the potential to eliminate the need for bulky and/or costly optical components through the help of novel theories and digital reconstruction algorithms. Along the same lines, here we demonstrate an on-chip fluorescent microscopy modality that can achieve e.g., &lt;4&mu;m spatial resolution over an ultra-wide field-of-view (FOV) of &gt;0.6-8 cm2 without the use of any lenses, mechanical-scanning or thin-film based interference filters. In this technique, fluorescent excitation is achieved through a prism or hemispherical-glass interface illuminated by an incoherent source. After interacting with the entire object volume, this excitation light is rejected by total-internal-reflection (TIR) process that is occurring at the bottom of the sample micro-fluidic chip. The fluorescent emission from the excited objects is then collected by a fiber-optic faceplate or a taper and is delivered to an optoelectronic sensor array such as a charge-coupled-device (CCD). By using a compressive-sampling based decoding algorithm, the acquired lensfree raw fluorescent images of the sample can be rapidly processed to yield e.g., &lt;4&mu;m resolution over an FOV of &gt;0.6-8 cm2. Moreover, vertically stacked micro-channels that are separated by e.g., 50-100 &mu;m can also be successfully imaged using the same lensfree on-chip microscopy platform, which further increases the overall throughput of this modality. This compact on-chip fluorescent imaging platform, with a rapid compressive decoder behind it, could be rather valuable for high-throughput cytometry, rare-cell research and microarray-analysis.

A lensless on-chip fluorescent microscopy platform is demonstrated that can image fluorescent objects over an ultra-wide field-of-view of e.g., &#62;0.6-8 cm2 with &#60;4&#956;m resolution using a compressive sampling based decoding algorithm. Such a compact and wide-field fluorescent on-chip imaging modality could be valuable for high-throughput cytometry, rare-cell research and microarray-analysis.

نيون الميكروسكوب Lensless على رقاقة

On-chip lensless imaging in general aims to replace bulky lens-based optical microscopes with simpler and more compact designs, especially for ...

Bioengineering

Compact Lens-less Digital Holographic Microscope for MEMS Inspection and Characterization

A micro-electro-mechanical-system (MEMS) is a widely used component in many industries, including energy, biotechnology, medical, communications, and automotive. However, effective inspection and characterization metrology systems are needed to ensure the functional reliability of MEMS. This study presents a system based on digital holography as a tool for MEMS metrology. Digital holography has gained increasing attention in the past 20 years. With the fast development and decreasing cost of sensor arrays, resolution of such systems has increased broadening potential applications. Thus, it has attracted attention from both research and industry sides as a potential reliable tool for industrial metrology. Indeed, by recording the interference pattern between an object beam (which contains sample height information) and a reference beam on a CCD camera, one can retrieve the quantitative phase information of an object. However, most of digital holographic systems are bulky and thus not easy to implement on industry production lines. The novelty of the system presented is that it is lens-less and thus very compact. In this study, it is shown that the Compact Digital Holographic Microscope (CDHM) can be used to evaluate several characteristics typically consider as criteria in MEMS inspections. The surface profiles of MEMS in both static and dynamic conditions are presented. Comparison with AFM is investigated to validate the accuracy of the CDHM.

We present a compact reflection digital holographic system (CDHM) for inspection and characterization of MEMS devices. A lens-less design using a diverging input wave providing natural geometrical magnification is demonstrated. Both static and dynamic studies are presented.

المدمجة عدسة أقل الرقمي المجسم مجهر لفحص ممس وتوصيف

A micro-electro-mechanical-system (MEMS) is a widely used component in many industries, including energy, biotechnology, medical, communications, and ...

Engineering

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a combination of bright field and differential interference contrast imagery. Two primary approaches are presented: noninterferometric quantitative phase microscopy (NIQPM), to perform measurements of total cell mass and subcellular density distribution, and Hilbert transform differential interference contrast microscopy (HTDIC)&#160;to determine volume. NIQPM is based on a simplified model of wave propagation, termed the paraxial approximation, with three underlying assumptions: low numerical aperture (NA) illumination, weak scattering, and weak absorption of light by the specimen. Fortunately, unstained cellular specimens satisfy these assumptions and low NA illumination is easily achieved on commercial microscopes. HTDIC is used to obtain volumetric information from through-focus DIC imagery under high NA illumination conditions. High NA illumination enables enhanced sectioning of the specimen along the optical axis. Hilbert transform processing on the DIC image stacks greatly enhances edge detection algorithms for localization of the specimen borders in three dimensions by separating the gray values of the specimen intensity from those of the background. The primary advantages of NIQPM and HTDIC lay in their technological accessibility using &#8220;off-the-shelf&#8221; microscopes. There are two basic limitations of these methods: slow z-stack acquisition time on commercial scopes currently abrogates the investigation of phenomena faster than 1 frame/minute, and secondly, diffraction effects restrict the utility of NIQPM and HTDIC to objects from 0.2 up to 10 (NIQPM) and 20 (HTDIC) &#956;m in diameter, respectively. Hence, the specimen and its associated time dynamics of interest must meet certain size and temporal constraints to enable the use of these methods. Excitingly, most fixed cellular specimens are readily investigated with these methods.

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

المجهر الضوئي الكمية: قياس الخلوية البيوفيزيائية الميزات مع مجهر بصري قياسي

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

Demonstration of a Hyperlens-integrated Microscope and Super-resolution Imaging

The use of super-resolution imaging to overcome the diffraction limit of conventional microscopy has attracted the interest of researchers in biology and nanotechnology. Although near-field scanning microscopy and superlenses have improved the resolution in the near-field region, far-field imaging in real-time remains a significant challenge. Recently, the hyperlens, which magnifies and converts evanescent waves into propagating waves, has emerged as a novel approach to far-field imaging. Here, we report the fabrication of a spherical hyperlens composed of alternating silver (Ag) and titanium oxide (TiO2) thin layers. Unlike a conventional cylindrical hyperlens, the spherical hyperlens allows for two-dimensional magnification. Thus, incorporation into conventional microscopy is straightforward. A new optical system integrated with the hyperlens is proposed, allowing for a sub-wavelength image to be obtained in the far-field region in real time. In this study, the fabrication and imaging setup methods are explained in detail. This work also describes the accessibility and possibility of the hyperlens, as well as practical applications of real-time imaging in living cells, which can lead to a revolution in biology and nanotechnology.

The use of a hyperlens has been regarded as a novel super-resolution imaging technique due to its advantages in real-time imaging and its simple implementation with conventional optics. Here, we present a protocol describing the fabrication and imaging applications of a spherical hyperlens.

مظاهرة مجهر المتكاملة هايبرلينس وتصوير القرار فائقة

The use of super-resolution imaging to overcome the diffraction limit of conventional microscopy has attracted the interest of researchers in biology and ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

حل غاية intravital المجهري مخطط في الإضاءة مراكز جرمينال

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Immunology and Infection

Optical Scatter Microscopy Based on Two-Dimensional Gabor Filters

We demonstrate a microscopic instrument that can measure subcellular texture arising from organelle morphology and organization within unstained living cells. The proposed instrument extends the sensitivity of label-free optical microscopy to nanoscale changes in organelle size and shape and can be used to accelerate the study of the structure-function relationship pertaining to organelle dynamics underlying fundamental biological processes, such as programmed cell death or cellular differentiation. The microscope can be easily implemented on existing microscopy platforms, and can therefore be disseminated to individual laboratories, where scientists can implement and use the proposed methods with unrestricted access.
The proposed technique is able to characterize subcellular structure by observing the cell through two-dimensional optical Gabor filters. These filters can be tuned to sense with nanoscale (10's of nm) sensitivity, specific morphological attributes pertaining to the size and orientation of non-spherical subcellular organelles. While based on contrast generated by elastic scattering, the technique does not rely on a detailed inverse scattering model or on Mie theory to extract morphometric measurements. This technique is therefore applicable to non-spherical organelles for which a precise theoretical scatter description is not easily given, and provides distinctive morphometric parameters that can be obtained within unstained living cells to assess their function. The technique is advantageous compared with digital image processing in that it operates directly on the object's field transform rather than the discretized object's intensity. It does not rely on high image sampling rates and can therefore be used to rapidly screen morphological activity within hundreds of cells at a time, thus greatly facilitating the study of organelle structure beyond individual organelle segmentation and reconstruction by fluorescence confocal microscopy of highly magnified digital images of limited fields of view.
In this demonstration we show data from a marine diatom to illustrate the methodology. We also show preliminary data collected from living cells to give an idea of how the method may be applied in a relevant biological context.

We demonstrate a dark-field microscopy method based on Gabor-like filtering to measure subcellular dynamics within single living cells. The technique is sensitive to alterations in the structure of organelles, such as mitochondrial fragmentation.

الميكروسكوب الضوئي مبعثر استنادا فلاتر غابور ثنائي الأبعاد

We demonstrate a microscopic instrument that can measure subcellular texture arising from organelle morphology and organization within unstained living ...

Uncovering Hidden Dynamics of Natural Photonic Structures Using Holographic Imaging

In this method, the potential of optics and holography to uncover hidden details of a natural system's dynamical response at the nanoscale is exploited. In the first part, the optical and holographic studies of natural photonic structures are presented as well as conditions for the appearance of the photophoretic effect, namely, the displacement or deformation of a nanostructure due to a light-induced thermal gradient, at the nanoscale. This effect is revealed by real-time digital holographic interferometry monitoring the deformation of scales covering the wings of insects induced by temperature. The link between geometry and nanocorrugation that leads to the emergence of the photophoretic effect is experimentally demonstrated and confirmed. In the second part, it is shown how holography can be potentially used to uncover hidden details in the chemical system with nonlinear dynamics, such as the phase transition phenomenon that occurs in complex oscillatory Briggs-Rauscher (BR) reaction. The presented potential of holography at the nanoscale could open enormous possibilities for controlling and molding the photophoretic effect and pattern formation for various applications such as particle trapping and levitation, including the movement of unburnt hydrocarbons in the atmosphere and separation of different aerosols, decomposition of microplastics and fractionation of particles in general, and assessment of temperature and thermal conductivity of micron-size fuel particles.

The paper is primarily focused on the combined power of optical (linear and nonlinear) and holographic methods used to reveal phenomena at the nanoscale. The results obtained from the biophotonic and oscillatory chemical reactions' studies are given as representative examples, highlighting holography's ability to reveal dynamics at a nanoscale.

الكشف عن الديناميكيات الخفية للهياكل الضوئية الطبيعية باستخدام التصوير المجسم

In this method, the potential of optics and holography to uncover hidden details of a natural system's dynamical response at the nanoscale is exploited. ...

Chemistry

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM)

Accurately detecting and counting sparse bacterial samples has many applications in the food, beverage, and pharmaceutical processing industries, in medical diagnostics, and for life detection by robotic missions to other planets and moons of the solar system. Currently, sparse bacterial samples are counted by culture plating or epifluorescence microscopy. Culture plates require long incubation times (days to weeks), and epifluorescence microscopy requires extensive staining and concentration of the sample. Here, we demonstrate how to use off-axis digital holographic microscopy (DHM) to enumerate bacteria in very dilute cultures (100-104 cells/mL). First, the construction of the custom DHM is discussed, along with detailed instructions on building a low-cost instrument. The principles of holography are discussed, and a statistical model is used to estimate how long videos should be to detect cells, based on the optical performance characteristics of the instrument and the concentration of the bacterial solution (Table 2). Video detection of cells at 105, 104, 103, and 100 cells/mL is demonstrated in real time using un-reconstructed holograms. Reconstruction of amplitude and phase images is demonstrated using an open-source software package.

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy DHM

Digital holographic microscopy (DHM) is a volumetric technique that allows imaging samples 50-100X thicker than brightfield microscopy at comparable resolution, with focusing performed post-processing. Here DHM is used for identifying, counting, and tracking microorganisms at very low densities and compared with optical density measurements, plate count, and direct count.

التحديد الكمي للكائنات الحية الدقيقة في تركيزات منخفضة باستخدام المجهر المجسم الرقمي (DHM)

Accurately detecting and counting sparse bacterial samples has many applications in the food, beverage, and pharmaceutical processing industries, in ...

A Guide to Build a Highly Inclined Swept Tile Microscope for Extended Field-of-view Single-molecule Imaging

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain large field-of-view, high-contrast images in thick cells and tissues. Here, we introduce highly inclined swept tile (HIST) microscopy that overcomes this problem. A pair of cylindrical lenses was implemented to generate an elongated excitation beam that was scanned over a large imaging area via a fast galvo mirror. A 4f configuration was used to position optical components. A scientific complementary metal-oxide semiconductor camera detected the fluorescence signal and blocked the out-of-focus background with a dynamic confocal slit synchronized with the beam sweeping. We present a step-by-step instruction on building the HIST microscope with all basic components.

A detailed instruction is described on how to build a highly inclined swept tile (HIST) microscope and its usage for single-molecule imaging.

دليل لبناء يميل درجة عالية اجتاحت بلاط المجهر لتصوير جزيء مفرد الحقل لعرض موسع

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain ...

Evaluation and Manipulation of Neural Activity Using Two-Photon Holographic Microscopy

Recent advances in optical bioimaging and optogenetics have enabled the visualization and manipulation of biological phenomena, including cellular activities, in living animals. In the field of neuroscience, detailed neural activity related to brain functions, such as learning and memory, has now been revealed, and it has become feasible to artificially manipulate this activity to express brain functions. However, the conventional evaluation of neural activity by two-photon Ca2+ imaging has the problem of low temporal resolution. In addition, manipulation of neural activity by conventional optogenetics through the optic fiber can only simultaneously regulate the activity of neurons with the same genetic background, making it difficult to control the activity of individual neurons. To solve this issue, we recently developed a microscope with a high spatiotemporal resolution for biological applications by combining optogenetics with digital holographic technology that can modify femtosecond infrared laser beams. Here, we describe protocols for the visualization, evaluation, and manipulation of neural activity, including the preparation of samples and operation of a two-photon holographic microscope (Figure 1). These protocols provide accurate spatiotemporal information on neural activity, which may be useful for elucidating the pathogenesis of neuropsychiatric disorders that lead to abnormalities in neural activity.

We developed a two-photon holographic microscope that can visualize, assess, and manipulate neural activity using high spatiotemporal resolution, with the aim of elucidating the pathogenesis of neuropsychiatric disorders that are associated with abnormal neural activity.