وأيد هذا البحث من خلال منحة من المعهد الوطني للصحة وجامعة تكساس في أرلينغتون إنشاء صناديق لMM.

1. زراعة النباتات والبكتيريا إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لبدء هذا الإجراء زرع بذور Arabidopsis على ت 01:01:01 : V : V خليط من متوسط ​​النمو (ريدي الأرض وتخلط المكونات الشتلات ، أحد غرو) ، الفيرميكوليت غرامة ، والبيرلايت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو النباتات في غرفة النمو (22 درجة مئوية ، 12 ساعة من الضوء μmol / مم 2 / ثانية 100 يوميا و 65 ± 5 ٪ رطوبة) والماء حسب الحاجة. محطات جاهزة للاستخدام في 4-6 أسابيع عندما يكون لديهم أوراق الشباب توسعت بشكل كامل قبل انشقاقه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل يومين من بدء التجربة تعد ثقافة بكتيريا. خط الزائفة syringae من المخزون الجلسرين على تعديل المتوسطة LB (10 جم / لتر تريبتون ، 5 ز / لتر خلاصة الخميرة ، 5 ز / لتر كلوريد الصوديوم الهيدروجيني 7.0 ، وأجار 1.5 ٪) ، واحتضان لمدة 24 ساعة عند 28 درجة مئوية. استخدام ثقافة جديدة لإعداد اللقاح والثقافة لوحات تبدأ دائما من المخزونات الجلسرين والبكتيريا يصبح أقل ضراوة بعد الفرعي زراعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام البكتيريا التي تنمو على لوحة لبدء ثقافة 10 مل من السائل P. syringae في دورق مخروطي 50 مل. احتضان الثقافة بين عشية وضحاها حتى 28 درجة مئوية مع قوي يهز حتى تصل الكثافة البصرية أو OD في 600 نانومتر بين 0.8 و 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس OD في 600 وحصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 1360 x ج لمدة 10 دقائق. Resuspend الخلايا في الماء المقطر بحيث OD النهائي هو 0.2. OD هذا يتوافق مع 10 وحدات تشكيل مستعمرة 8 (CFU) / مليلتر. مع استعداد البكتيريا ، والمضي قدما لإعداد أوراق وأداء الفحص. </li></ol> 2. يلطخ الأوراق والحضانة مع البكتيريا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل إعداد أوراق صمة أول 20 ميكرومتر أو يوديد propidium PI حل في الماء. 10 مل من محلول يكفي لصبغ 3 يترك صغيرة في وقت واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استرداد النباتات من النمو وغرفة مع ملقط فصل 3 الشباب يترك بالكامل الموسع. تزج يترك كله في حل بي لمدة 5 دقائق. ثم إزالة يترك لهم فترة وجيزة وشطف مع الماء المقطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المكان التالي ورقة مع السطح السفلي لأسفل على شريحة المجهر. قطع ورقة بشفرة حلاقة حادة في أربعة قطع الوريد باستثناء منتصف بحيث يضع ورقة مسطحة على الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاحتضان هذه البكتيريا مع الأوراق ، وإضافة 300 ميكرولتر من تعليق الجرثومي تحت قطعة ورق على الشريحة. تأكد من أن السطح السفلي للورقة على اتصال مع اللقاح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان العينات تحت نفس الظروف البيئية التي كانت تستخدم لزراعة النباتات. في ذلك الوقت لمراقبة يترك تحت المجهر ، ونقل القطع ورقة لشريحة جديدة مع انخفاض سطح مواجهة. لاحظ أن لا يتم استخدام زلة تغطية عندما تصاعد الشرائح. ولا يمكن تصوير نموذج ورقة نفسه عدة مرات خلال الحضانة ، ويمكن تحديد مسار الزمن حتى وفقا لأهداف البحث. </li></ol> 3. المجهري والقياس وتحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هنا يستخدم ليزر المسح المجهر مبائر (LSM 510 ميتا ، وشركة كارل زايس) لفحص الأوراق. مراقبة السطح السفلي من الأوراق للكشف عن ومضان من PI (الإثارة 453 نانومتر ، وانبعاث 543 نانومتر 620). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام عينات من أوراق نفس التقاط الصور من الثغور على مر الزمن. حفظ الصور لقياس عرض الفتحة فوهي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس فوهي عرض فتحة لا يقل عن 60 الثغور لكل معاملة في كل نقطة زمنية باستخدام متصفح LSM الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب المتوسط ​​ومعيار الخطأ لعرض الفتحة فوهي. ويمكن حساب الدلالة الإحصائية للنتائج باستخدام 2 الذيل ، طالبة الحكمة المقترنة لاختبار t. </li></ol> 4. ممثل صور الاستجابة لفوهي الحضانة مع البكتيريا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هنا صورة نموذجية المجهرية (باستخدام هدفا 20X) من سطح الورقة Arabidopsis تحت مجهر المسح الضوئي ليزر متحد البؤر في مجال عرض مشرق (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البقع يوديد Propidium جدار الخلية من الخلايا قادرة على البقاء وزيادة وضوح من خلايا الحرس بالإضافة إلى السماح لتحديد الخلايا غير التالفة لجمع البيانات (الشكل 2). ويمكن رؤية مجموعة من فتحات المسام فوهي في هذه micrographs ، من الثغور مغلقة تماما لالثغور مفتوحة على مصراعيها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم تحديد الثغور مغلقة تماما من شكل خلايا الحرس (الشكل 3). ويعتبر عرض الفتحة لتكون 0 ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالثغور المفتوحة (الشكل 4) ويقاس عرض الفتحة أظهرت باستخدام خط مستقيم عبر رسمها على أوسع نطاق منطقة فوهي المسام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هذه هي النتائج التجريبية نموذجية من هذا الاختبار فوهي. Arabidopis يترك وحضنت في الظلام مع ثلاث سلالات مختلفة من syringae الزائفة. فقط للبكتيريا وكان توقيت المحيط الهادي DC3000 قادرا على فتح الثغور المغلقة المظلمة ، وتقاس على النحو الذي عرض فتحة الثغور 60 تم اختيارها عشوائيا في سلالة بكتيرية (الشكل 5). </li></oل&gt; <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. صورة مجهرية من السطح من نبات Arabidopsis. حقل واحد من عرض من سطح ورقة تحت المجهر متحد البؤر المسح بالليزر (LSCM) باستخدام الهدف 20X. علما بأن الفتحة فوهي ليس كما يتضح عند مقارنة عرض الفلورسنت بمساعدة من تلطيخ يوديد propidium (الشكل 2). <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. صورة مجهرية من سطح ورقة propidium Arabidopsis يوديد الملطخة. حقل واحد من عرض من سطح ورقة تحت المجهر متحد البؤر المسح بالليزر (LSCM) باستخدام الهدف 20X. لاحظ مجموعة من فتح المسام فوهي. وأشار إلى إغلاق الأسهم الصفراء تماما الثغور وأشار السهام الاخضر لالثغور مفتوحة على مصراعيها. <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. تماما الثغور التي حددتها وثيقة على شكل وفتح بين الحرس الخلايا ويعتبر العرض لتكون الفتحة 0 ميكرون. <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4. الثغور المفتوحة يظهر عرض الفتحة في ميكرون. أخذت قياسات باستخدام متصفح LSCM على أساس خط مستقيم عبر رسمها على أوسع مساحة فوهي المسام. <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig5.jpg" alt="الشكل 5" /> الشكل 5. بقيت DC3118 ، DB29 ، وDC3000 النباتات في الظلام خلال فترة التجريب : الفتحة فوهي من أوراق Arabidopsis المحتضنة مع ثلاث سلالات البندورة الكهروضوئية syringae الزائفة... وتظهر النتائج على النحو يعني (ن = 50-70) ± الخطأ القياسي. تم الكشف عن دلالة إحصائية مع تجارب ر ثنائي الطرف الطالب. وتكررت التجربة ثلاث مرات مع نتائج مماثلة.

<ol>
	<li>Brooks, D. M., Hernandez-Guzman, G., Kloek, A. P., Alarcon-Chaidez, F., Sreedharan, A., Rangaswamy, V., Penaloza-Vazquez, A., Bender, C. L., Kunkel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+well-defined+series+of+coronatine+biosynthetic+mutants+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000.">Identification and characterization of a well-defined series of coronatine biosynthetic mutants of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000.</a> Mol Plant-Microbe Interact. 17, 162-174 (2004).</li><li>Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y., Somerville, C. R., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+thaliana-Pseudomonas+syringae+interaction.">The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction.</a> The Arabidopsis Book. , (2002).</li><li>Ma, S. W., Morris, V. L., Cuppels, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+DNA+region+required+for+production+of+the+phytotoxin+coronatine+by+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato.">Characterization of a DNA region required for production of the phytotoxin coronatine by Pseudomonas syringae pv. tomato.</a> Mol Plant-Microbe Interact. 4, 69-74 (1991).</li><li>Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+stomata+function+in+innate+immunity+against+bacterial+invasion.">Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion.</a> Cell. 126, 969-980 (2006).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

قدمنا ​​إجراء مستقيم إلى الأمام لقياس الفتحة فوهي في أنسجة نبات سليمة تسمح بتقييم سهولة استجابة فوهي للعلاجات المختلفة. على الرغم من أننا قد قدمت النتائج باستخدام نظام نموذجي Arabidopsis / syringae الزائفة ، يمكن فحص أوراق سليمة فوهي تنفيذ محتملة مع أي مزيج من النباتات بكتيريا. ويمكن بسهولة البروتوكول يمكن تعديلها لتناسب متطلبات نمو النباتات الأخرى ، ومسببات الأمراض البكتيرية. والمبدأ العام والإجراءات لا تزال هي نفسها. بالإضافة إلى ذلك ، هذا الأسلوب قد تكون مفيدة للباحثين الذين يرغبون في الدراسة الفنية للانتاج خلايا الحرس ليس فقط للعيش الميكروبات ، ولكن أيضا لمنبهات أخرى ، والعوامل الكيميائية في ظل الظروف التي تحافظ على البيئة الطبيعية لنبات. يمكن نبات كله يكون من الصعب الصورة بسبب سماكة والتضاريس متفاوتة. ويمكن التخفيف من حدة هذه المشكلة عن طريق إزالة الوريد منتصف الورقة بحيث يضع مسطح على الشريحة وباستخدام المجهر مبائر. ومع ذلك ، يمكن استخدام أنواع أخرى من مضان المجهر للحصول على صور عالية الدقة لسطح الورقة.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Propidium iodide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>P4864</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tryptone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP1421-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast Extract</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>0127-01-7</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>7647-14-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio Express</td>
<td>J637-2500G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plant growth chamber</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Shaker incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laser scanning confocal microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

assessing stomatal response to live bacterial cells using whole leaf imaging

الثغور هي الفتحات الطبيعية في البشرة النباتية المسؤولة عن تبادل الغازات بين النبات والبيئة الداخلية. تتشكل من قبل زوج من خلايا الحرس ، والتي هي قادرة على إغلاق المسام فوهي ردا على عدد من العوامل الخارجية بما في ذلك شدة الضوء ، تركيز ثاني أكسيد الكربون ، والرطوبة النسبية (RH). المسام فوهي هو أيضا الطريق الرئيسي لدخول العامل الممرض في الأوراق ، وخطوة حاسمة بالنسبة لتطور المرض. وقد كشفت الدراسات الحديثة أن إغلاق المسام فعال في الحد من تطور المرض الجرثومي في النباتات Arabidopsis ، جزءا لا يتجزأ من مناعة النبات الفطرية. سابقا ، وقد استخدمنا قشور البشرة لتقييم الاستجابة للعيش فوهي البكتيريا (Melotto وآخرون 2006) ؛ الحفاظ على الظروف البيئية غير المواتية لقشور النبات على حد سواء البشرة والخلايا البكتيرية قد التحدي. يمكن أن تبقى على قيد الحياة ورقة البشرة وصحية مع العازلة زارة التربية والعلم (10 ملي بوكل ، 25 مم ، MES كوه ، ودرجة الحموضة 6.15) للتجارب الكهربية للخلايا الحراسة. ومع ذلك ، هذا المخزن ليس من المناسب للحصول على تعليق البكتيرية. من ناحية أخرى ، يمكن أن تبقى على قيد الحياة في الخلايا البكتيرية الماء الذي ليس من المناسب للحفاظ على القشور البشرة لفترة طويلة من الوقت. عندما يطفو على الماء قشر البشرة ، والخلايا في القشرة التي تتعرض لجفاف الهواء في غضون 4 ساعات الحد من توقيت لإجراء التجربة. يجب على الأسلوب الأمثل لتقييم تأثير حافز خاص على خلايا الحرس الحاضر إلى الحد الأدنى من التدخل الفيزيولوجيا فوهي وعلى البيئة الطبيعية من النبات قدر الإمكان. نحن ، بالتالي ، وضعت طريقة جديدة لتقييم الاستجابة للعيش فوهي البكتيريا التي يتم تصغير كثيرا اصابة الأوراق والتلاعب التي تهدف إلى توفير مقايسة استنساخه بسهولة وموثوق بها فوهي. يستند هذا البروتوكول على تلوين أوراق سليمة مع يوديد propidium (PI) ، حضانة تلوين نبات مع تعليق البكتيرية ، والمراقبة من أوراق تحت مجهر المسح الضوئي ليزر متحد البؤر. أخيرا ، وهذا الأسلوب يسمح للمراقبة من العينة نبات يعيش نفسه على مدى فترات طويلة من الوقت باستخدام الظروف التي تحاكي بشكل وثيق في ظل الظروف الطبيعية التي تتعرض للهجوم من قبل النباتات مسببات الأمراض.

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging at JoVE.com

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

قمنا بتطوير بروتوكول بسيطة وقابلة للتكرار للوصول إلى استجابة فوهي للبكتيريا حية. هذا الأسلوب يقلل من اصابة والتلاعب في أوراق بالمقارنة مع استخدام قشور البشرة ذكرت سابقا.

تقييم الاستجابة للعيش فوهي الخلايا البكتيرية باستخدام التصوير الجامعة ليف

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

assessing-stomatal-response-to-live-bacterial-cells-using-whole-leaf

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.3K Views.  University of Texas at Arlington. قمنا بتطوير بروتوكول بسيطة وقابلة للتكرار للوصول إلى استجابة فوهي للبكتيريا حية. هذا الأسلوب يقلل من اصابة والتلاعب في أوراق بالمقارنة مع استخدام قشور البشرة ذكرت سابقا.

Video: Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

Luciferase به لالتهابات جرثومية في صورة الفئران

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

تعيش خلية من التصوير<emالعصوية الرقيقة> و العقدية الرئوية الآلي باستخدام الميكروسكوب مرور الزمن

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external environment. The cell can either recover from this insult, which requires active membrane repair processes, or else die depending on the amount of toxin exposure and cell type1. In addition, these toxins induce strong inflammatory responses in infected hosts through activation of immune cells, including macrophages, which produce an array of pro-inflammatory cytokines2. Many Gram positive bacteria produce cholesterol binding toxins which have been shown to contribute to their virulence through largely uncharacterized mechanisms.
Morphologic changes in the plasma membrane of cells exposed to these toxins include their sequestration into cholesterol-enriched surface protrusions, which can be shed into the extracellular space, suggesting an intrinsic cellular defense mechanism3,4. This process occurs on all cells in the absence of metabolic activity, and can be visualized using EM after chemical fixation4. In immune cells such as macrophages that mediate inflammation in response to toxin exposure, induced membrane vesicles are suggested to contain cytokines of the IL-1 family and may be responsible both for shedding toxin and disseminating these pro-inflammatory cytokines5,6,7. A link between IL-1&beta; release and a specific type of cell death, termed pyroptosis has been suggested, as both are caspase-1 dependent processes8. To sort out the complexities of this macrophage response, which includes toxin binding, shedding of membrane vesicles, cytokine release, and potentially cell death, we have developed labeling techniques and fluorescence microscopy methods that allow for real time visualization of toxin-cell interactions, including measurements of dysfunction and death (Figure 1). Use of live cell imaging is necessary due to limitations in other techniques. Biochemical approaches cannot resolve effects occurring in individual cells, while flow cytometry does not offer high resolution, real-time visualization of individual cells. The methods described here can be applied to kinetic analysis of responses induced by other stimuli involving complex phenotypic changes in cells.

Methods for purifying the cholesterol binding toxin streptolysin O from recombinant E. coli and visualization of toxin binding to live eukaryotic cells are described. Localized delivery of toxin induces rapid and complex changes in targeted cells revealing novel aspects of toxin biology.

تصور الردود السم البكتيري المستحثة عن طريق لايف مضان المجهري الخليوي

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of bacteria in gene and cell therapy for cancer. Bacteria present an attractive class of vector for cancer therapy, possessing a natural ability to grow preferentially within tumors following systemic administration. Bacteria engineered to express the lux gene cassette permit BLI detection of the bacteria and concurrently tumor sites. The location and levels of bacteria within tumors over time can be readily examined, visualized in two or three dimensions. The method is applicable to a wide range of bacterial species and tumor xenograft types. This article describes the protocol for analysis of bioluminescent bacteria within subcutaneous tumor bearing mice. Visualization of commensal bacteria in the Gastrointestinal tract (GIT) by BLI is also described. This powerful, and cheap, real-time imaging strategy represents an ideal method for the study of bacteria in vivo in the context of cancer research, in particular gene therapy, and infectious disease. This video outlines the procedure for studying lux-tagged E. coli in live mice, demonstrating the spatial and temporal readout achievable utilizing BLI with the IVIS system.

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

This article describes the administration of lux-tagged bacteria to mice and subsequent in vivo analysis using IVIS bioluminescence imaging.

البكتيرية التصوير Bioluminescent<em&gt; في الجسم الحي</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome organization are governed by DNA-binding proteins that recognize specific DNA structures or sequences. In vitro experiments have helped to generate detailed models for the function of many types of DNA-binding proteins, yet, the exact mechanisms of these processes and their organization in the complex environment of the living cell remain far less understood. We recently introduced a method for quantifying DNA-repair activities in live Escherichia coli cells using Photoactivated Localization Microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking. Our general approach identifies individual DNA-binding events by the change in the mobility of a single protein upon association with the chromosome. The fraction of bound molecules provides a direct quantitative measure for the protein activity and abundance of substrates or binding sites at the single-cell level. Here, we describe the concept of the method and demonstrate sample preparation, data acquisition, and data analysis procedures.

Photoactivated localization microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking allows direct observation and quantification of protein-DNA interactions in live Escherichia coli cells.

تصور التفاعلات الحمض النووي البروتين في الخلايا البكتيرية عن طريق لايف Photoactivated تتبع جزيء واحدة

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised patients, the elderly, and pregnant women. The most common manifestations of listeriosis in humans include meningitis, encephalitis, and fetal abortion. A significant but much less documented sequelae of invasive L. monocytogenes infection involves the heart. The death rate from cardiac illness can be up to 35% despite treatment, however very little is known regarding L. monocytogenes colonization of cardiac tissue and its resultant pathologies. In addition, it has recently become apparent that subpopulations of L. monocytogenes have an enhanced capacity to invade and grow within cardiac tissue. This protocol describes in detail in vitro and in vivo methods that can be used for assessing cardiotropism of L. monocytogenes isolates. Methods are presented for the infection of H9c2 rat cardiac myoblasts in tissue culture as well as for the determination of bacterial colonization of the hearts of infected mice. These methods are useful not only for identifying strains with the potential to colonize cardiac tissue in infected animals, but may also facilitate the identification of bacterial gene products that serve to enhance cardiac cell invasion and/or drive changes in heart pathology. These methods also provide for the direct comparison of cardiotropism between multiple L. monocytogenes strains.

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causes fetal infections in pregnant women and meningitis in susceptible populations. Subpopulations of bacteria can colonize cardiac tissue, causing myocarditis in patients and laboratory animals. Here we present a protocol that describes how to assess L. monocytogenes cardiac cell invasion in vitro and cardiac colonization in infected animals.

تقييم الغزو البكتيري لخلايا القلب في الثقافة والاستعمار القلب في الفئران المصابة باستخدام monocytogenes الليستيريا

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

جيل ومتعدد المظهري فحص عالية المحتوى من<em&gt; الكوكسيلا البورنيتية</em&gt; المسوخ ينقول

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend themselves against pathogen attack. The contribution of a specific Arabidopsis gene to the overall plant immune response can be specifically and quantitatively assessed by assaying the pathogen growth within the infected tissue. For over three decades, the hemibiotrophic bacterium Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 (Psm ES4326) has been widely applied as the model pathogen to investigate the molecular mechanisms underlying the Arabidopsis immune response. To deliver pathogens into the leaf tissue, multiple inoculation methods have been established, e.g., syringe infiltration, dip inoculation, spray, vacuum infiltration, and flood inoculation. The following protocol describes an optimized syringe infiltration method to deliver virulent Psm ES4326 into leaves of adult soil-grown Arabidopsis plants and accurately screen for enhanced disease susceptibility (EDS) towards this pathogen. In addition, this protocol can be supplemented with multiple pre-treatments to further dissect specific immune defects within different layers of plant defense, including Salicylic Acid (SA)-Triggered Immunity (STI) and MAMP-Triggered Immunity (MTI).

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Quantification of pathogen growth is a powerful tool to characterize various Arabidopsis thaliana (hereafter: Arabidopsis) immune responses. The method described here presents an optimized syringe infiltration assay to quantify the Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 growth in adult Arabidopsis leaves.

بكتيريا ورقة تسلل الفحص لتوصيف غرامة الردود الدفاع النبات باستخدام<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس thaliana-الزائفة syringae</em&gt; Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila express gustatory receptors1,2, ion channels3-6, and ionotropic receptors7 that are involved in the detection of volatile and non-volatile sensory cues. These neurons directly contact tastants such as food, noxious substances and pheromones and therefore influence many complex behaviors such as feeding, egg-laying and mating. Electrode recordings and calcium imaging have been widely used in insects to quantify the neuronal responses evoked by these tastants. However, electrophysiology requires specialized equipment and obtaining measurements from a single taste sensillum can be technically challenging depending on the cell-type, size, and position. In addition, single neuron resolution in Drosophila can be difficult to achieve since taste sensilla house more than one type of chemosensory neuron. The live calcium imaging method described here allows responses of single gustatory neurons in live flies to be measured. This method is especially suitable for imaging neuronal responses to lipid pheromones and other ligand types that have low solubility in water-based solvents.

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.

قياس الاستجابات الفسيولوجية لل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الخلايا العصبية الحسية إلى الدهن الفيرومونات عن طريق لايف التصوير الكالسيوم

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research investigating immunological responses against A. fumigatus has been limited by the lack of consistent and reliable assays for measuring the antifungal activity of specific immune cells in vitro. A new method is described to assess the antifungal activity of primary monocytes and neutrophils from human donors against A. fumigatus using FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia. These conidia contain a genetically encoded dsRed reporter, which is constitutively expressed by live FLARE conidia, and are externally labeled with Alexa Fluor 633, which is resistant to degradation within the phagolysosome, thus allowing a distinction between live and dead A. fumigatus conidia. Video microscopy and flow cytometry are subsequently used to visualize the interaction between conidia and innate immune cells, assessing fungicidal activity whilst also providing a wealth of information on phagocyte migration, phagocytosis and the inhibition of fungal growth. This novel technique has already provided exciting new insights into the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus. It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.
It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Here, we describe a protocol to assess antifungal activity of primary human immune cells in real-time using fluorescent Aspergillus reporter conidia in conjunction with live-cell video microscopy and flow cytometry. Generated data provide insight into host cell-Aspergillus interactions such as fungicidal activity, phagocytosis, cell migration and inhibition of fungal growth.

التصوير المباشر لآخر مضاد من قبل العدلات الإنسان الأساسية وحيدات في الاستجابة لل<em&gt; A. فوميجاتوس</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...